蛋白质结晶学和X光衍射基础

蛋白质结晶学和X光衍射基础分子酶学工程教育部重点实验室郑柏松讲师生物物理学－－生物大分子结构解析授课内容•历史的回顾•X光衍射原理•蛋白质表达、纯化•蛋白质结晶•X光衍射及数据收集•结构解析授课目的•了解生物物理学发展历史与前沿；•掌握蛋白质结晶学和X光衍射基础知识；•开阔视野－－贴近国际一流结构生物学实验室；•培养兴趣－－增强对科研工作的感性和理性认识。蛋白质三维结构测定方法•X-射线晶体学•电子显微学(低温电子显微技术与三维象重构）•核磁共振波谱学1895年德国物理学家伦琴发现X射线并因此获得1901年首届诺贝尔物理学奖，X射线历经110年跨越3个世纪，由于众多学者在探索X射线性质、应用、仪器等方面的创新性研究，先后有29位物理学家、晶体学家、化学家、分子生物学家等分别获得了物理（7项）、化学（9项）、生理学或医学（3项）总计19项诺贝尔奖。历史的回顾1912年劳厄获得了X射线通过晶体后产生的衍射斑点图像（劳厄衍射图），证明了X射线的波动性及其波长范围。随后提出了表示原子排列周期与X射线波长间关系的著名的衍射方程（劳厄方程），并成功地解释了晶体衍射的实验结果。英国物理学家布拉格父子、达尔文等人发展了X射线衍射理论，类比光学反射原理提出了表示晶体结构（晶面间距d）、X射线波长（λ）与衍射方位（）间的关系的布拉格方程，提出了嵌镶晶体、完整晶体和包含有原子热运动诸因素的衍射强度公式，阐明了X射线通过晶体产生衍射的付里叶变换本质，获得了X射线的连续光谱与取决于阴极材料的特征光谱。历史的回顾最终X射线衍射成为有机分子（特别是生物活性分子）立体结构测定的有力工具，为研究生理活性物质（药物分子）的立体结构、结构改造、结构预测、结构－功能关系为目标的有机晶体学科奠定了基础。对于生物大分子的研究，始于30年代中期，贝纳尔和藿奇金开始用X射线衍射方法研究胃蛋白酶的晶体结构，但直到布拉格主持凯文迪实验室后，才使得这一工作取得突破，为创建分子生物学科奠定了基础。1953年沃森和克里克根据X衍射实验数据建立了脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结构，并因此获得1962年的诺贝尔生理学和医学奖。历史的回顾肯德鲁和佩卢茨从30年代开始，应用X衍射方法研究肌红蛋白与血红蛋白的晶体结构，历经20多年的艰苦努力，在众多科学家的共同参与下，终于在1960年获得了这两个蛋白质的三维结构，并因此荣获1962年的诺贝尔化学奖。在1957至1967年的10年中，相继用X衍射方法测定了溶菌酶、胰岛素、胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶的高分辨晶体结构。戴森豪菲尔和胡贝尔、米海尔因测定紫色细菌光合作用中心的三维结构而获得1988年的诺贝尔化学奖，形成了新的蛋白质晶体学科与结构分子生物学科。历史的回顾X-射线X射线和可见光一样属于电磁辐射，但其波长比可见光短得多，介于紫外线与γ射线之间，约为10－2到102埃的范围。X光衍射原理X-射线X光衍射原理1.X射线和其它电磁波一样，能产生反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振和吸收等现象。但是，在通常实验条件下，很难观察到X射线的反射。不可能像可见光那样用透镜成像。对于所有的介质，X射线的折射率n都很接近于1（但小于1），所以几乎不能被偏折到任一有实际用途的程度。2.在物质的微观结构中，原子和分子的距离（1～10埃左右）正好落在X射线的波长范围内，所以物质（特别是晶体）对X射线的散射和衍射能够传递极为丰富的微观结构信息。X射线衍射方法是当今研究物质微观结构的主要方法。3.X射线穿透物质时都会被部分吸收,其强度将被衰减变弱；吸收的程度与物质的组成、密度和厚度有关。在此过程中X射线与物质的相互作用是很复杂的，会引起多种效应。例如，可以使气体电离；使一些物质发出可见的荧光；能破坏物质的化学键，引起化学分解，也能促使新键的形成，促进物质的合成；作用于生物细胞组织，还会导致生理效应，使新陈代谢发生变化甚至造成辐射损伤。4.X射线散射的过程又可分为两种，一种是只引起X射线方向的改变，不引起能量变化的散射，称为相干散射，这是X射线衍射的物理基础；另一种是既引起X射线光子方向改变，也引起其能量的改变的散射，称为不相干散射或康普顿散射（或康普顿效应），此过程同时产生反冲电子（光电子）。衍射的几何方程布拉格方程劳埃（Laue）方程X射线照射到晶体上发生散射，其中衍射现象是X射线被晶体散射的一种特殊表现。晶体的基本特征是其微观结构（原子、分子或离子的排列）具有周期性，当X射线被散射时，散射波中与入射波波长相同的相干散射波，会互相干涉，在一些特定的方向上互相加强，产生衍射线。晶体可能产生衍射的方向决定于晶体微观结构的类型（晶胞类型）及其基本尺寸（晶面间距，晶胞参数等）；而衍射强度决定于晶体中各组成原子的元素种类及其分布排列的坐标。X光衍射原理X光衍射原理劳埃（Laue）方程和布拉格（Bragg）方程确定了衍射方向与晶体结构基本周期的关系，通过对衍射方向的测量，理论上我们可以确定晶体结构的对称类型和晶胞参数。而X射线对于晶体的衍射强度则决定于晶体中原子的元素种类及其排列分布的位置。X光衍射原理Whatwecando？挑战和机遇？？？•克隆、表达、纯化•结晶•数据收集及处理•相角的测定•相角的改进（优化）•电子密度图的解释•修正•结构的描述和与功能关系的研究StructuralBiologyProcessesRecombinantproteinover-expressionandpurificationExpressionsystems:1.Bacteriasystem2.Yeast3.Insectcells4.Mammaliancells5.Cell-freesystem蛋白质表达、纯化SomeVectorsforE.coliExpressionSystem蛋白质表达、纯化ProteinExpressioninYeastCloningoftargetgenetovectorTransformtoyeastPichiapastorisSelectionofrecombinantyeaststrainYeastcellcultureforproteinproduction蛋白质表达、纯化ProteinExpressioninInsectCellsAfterrecombinationCloningoftargetgenetopFastBacTransformtobacteriawithBacmidBacmidtransfectedtoinsectcellsVirusassemblyininsectcellsVirusesinfectInsectCellsforproteinproductionStrainsforexpression:Sf9,Sf21,Hi5蛋白质表达、纯化TransientExpressionInMammalianCells293EcellcanbeculturedinsuspensionmediumRecombinantplasmidwithtargetgeneTransfectto293EcellswithPEIHarvestcellsforproteinpurification蛋白质表达、纯化293EBNA1CellsWithGFPExpressingVectorABA.Wholecellsonplate;B.CellsinthesameplatetoAviewedbyGFPflorescence蛋白质表达、纯化RecombinantProteinsExpressionIn293EBNA1CellsLanes:1.Proteinstandard;2.Controlwhole293Ecells;3.GFPexpressed293Ecells;4.HCF-1N380expressed293Ecells;5.HCF-1N16-363expressed293Ecells.Recombinantprotein1(lane4)12345142031456794Recombinantprotein2(lane5)GFP(lane3)蛋白质表达、纯化Cell-freeSystemforProteinProductionSometimesitcanproducesolubleproteinwhichcannotbeexpressedassolubleformwithcellularsystem.Roche:RapidTranslationSystem(RTS)RapidproteinexpressionToxicproteinexpression蛋白质表达、纯化1.Protein－ProteinComplexExpressionandPurification:a.Proteinsexpressseparately;b.Proteinsco-expressinonecell.2.Protein-NucleicAcid：a.Protein-DNAComplex；b.Protein-RNAComplex.ProducingProteinComplexesforCrystallization蛋白质表达、纯化•MethodsforproductionofrecombinantproteincomplexesbyinvivoreconstitutioninE.coli1.Usecompatiblevectors,suchaspMR101(p15Aori)andpET15B(pBR322ori);2.Useonevectorwithmorethanoneexpressioncassettes--polycistronic；Benefitsofinvivoreconstitution(coexpression)•efficiency–oneroundofexpression–oneroundofpurification•quality–coexpressionandcofoldingofpolypeptidesinthepresenceofcellularchaperonesmayincreaseyieldoffunctionalcomplexProtein－ProteinComplexExpressionandPurification蛋白质表达、纯化Protein－DNAComplex1.Proteinsolubility:higherinhighsaltbufferusually;2.Protein-DNAcomplexstability:morestablethanproteinalone;3.DNAlengthandsequenceusedforcrystallization:a.additionalbasepairs;b.stickyends;4.PurificationofDNAoligos:HPLCwithhydrophobicinteraction,C4etc;5.Trappingreactionintermediate:disulfidebridge;proteinpointmutation,etc;6.Preparationofprotein-DNAcomplexes:mixwithextramolarDNA;7.Crystallization:PEGorMPDinlowslatbuffer;8.Example:over6000trialforprotein-DNAcomplex.蛋白质表达、纯化Protein-RNAComplexDifficulties:avoidofRNase!1.Phosphategroupsinterferecrystalpacking;2.ElongatedRNAspackloosely;RNAengineering:bluntorstickyends;deletion,replacement,etc;RNApreparation:1.Synthesis;2.Invitrotranscription;