脯氨酸含量测定

植物抗逆性的测定（脯氨酸快速测定法）在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，Barheff和Naylor（1966年）指出：在水分亏缺的情况下，引起蛋白质分解，而脯氨酸首先大量地被游离出来。植物内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱性的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒性的生理指标。（一）原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当有磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。（二）材料及设备1.材料仪器械：（1）待测植物（水稻、小麦、玉米、高梁、大豆均可）。（2）722分光光度计，（3）研钵，（4）100ml小烧杯，（5）容量瓶，（6）大试管2支，（7）普通式管8支，（8）移液管；（9）注射器；（10）水浴锅，（11）漏斗，（12）漏斗架，（13）滤纸，（14）剪刀。2.试剂（1）酸性茚三酮溶液：将1.25茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6M磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。（2）3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸蒸馏水溶解后定容至100ml。（3）冰醋酸，（4）甲苯（三）实验步骤1.标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100μg。（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，其每瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5，及6μg/ml/（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30分钟。（4）冷却后向各试管准确加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出密度（y）依脯氨酸浓度（x）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/ml）。2.样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称了以不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提了以10分钟，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液二另一干净的带玻璃试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚一桐试剂，在沸水浴中加热30分钟，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000μm下离心5分钟。（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得光密度。（四）结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：实验二十一植物体内游离脯氨酸含量的测定植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。【原理】采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nM处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。【仪器与用具】分光光度计：水浴锅；漏斗；20ml大试管数支；20Ml具塞刻度试管9支；5～10Ml注射器或滴管。【试剂】3％磺基水杨酸水溶液；甲苯；酸性茚三酮显色液；冰乙酸和6Mol／L磷酸以3∶2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3d有效；脯氨酸标准溶液：准确称取25Mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg／ml。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg／ml的脯氨酸标准液。【方法】标准曲线制作(1)取7支具塞刻度试管按表21-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40Min。(2)取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管为对照在波长520nM下比色。(3)以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。样品测定(1)脯氨酸提取取不同处理的剪碎混匀小麦叶片～干样根据水分含量酌减)，分别置于大试管中，加入5ml3％硝基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10Min。(2)取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2Ml，加2Ml冰乙酸和3Ml显色液，于沸水浴中加热40Min，下步操作按标准曲线制作方法进行甲苯萃取和比色。表21-1各试管中试剂加入量管号0123456标准脯氨酸量（ml)00.20.40.81.21.62.0H2O（ml)21.81.61.20.80.40冰乙酸（ml)2222222显色液（ml)3333333脯氨酸含量（μg)0248121620(3)结果计算从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。脯氨酸[μg／g(干或鲜样)〕＝(C×V／A)／W(21-1)式中C:提取液中脯氨酸浓度(μg)，由标准曲线求得；V:提取液总体积(Ml)；A:测定时所吸取的体积(ml)；W:样品重(g)。