高效液相色谱法在食品分析中的应用

高效液相色谱法在食品分析中的应用摘要综述高效液相色谱法在食品分析中的应用,主要介绍了高效液相色谱法在食品中黄曲霉毒素、食品中农兽、药残留量、食品中各种添加剂及食品贮藏过程产生毒素每方面的分析测定中的应用。基本上反应了高效液相色谱法在食品分析领域的最新应用。关键词:高效液相色谱法黄曲霉毒素残留农兽药添加剂毒素前言高效液相色谱法是六十年代末、七十年代初发展起来的快速分离分析的方法。它的基础是液相柱层析［1］。由于新型固定相、性能良好的高压输液泵以及具有选择性的高灵敏的检测器的使用,尤其是近年来利用电子计算机进行自动化控制及数据处理,使液相色谱法得到了很大的发展。高效液相色谱法被广泛应用于许多领域,同样亦被应用于食品分析领域。它不仅可以对食品中各类营养成分及含量进行分离和测定,而且还可以对食品中残留的一些有害的微量物质及在食品腐败过程中产生的各种毒素进行分析［2］,从而向人们展示出高效液相色谱法在食品分析中的重要地位。1高效液相色谱1.1高效液相色谱仪的组成不论何种类型高效液相色谱仪，基本上分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。(1)输液系统包括贮液罐、高压输液泵、梯度洗脱装置等。(2)进样系统是将待分析样品引入色谱柱的装置，包括取样、进样两个功能。(3)分离系统主要是指担负分离作用的色谱柱，它是色谱仪的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。(4)检测系统中的检测器可分为通用型检测器(对样品和洗脱液总的物理化学性质有响应)和选择型检测器(仅对待分离组分的物理化学性质有响应)。1.2高效液相色谱法的特点分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广。1.3高效液相色谱法几种分离模式的分离原理高效液相色谱法按组分在两相间分离机理的不同主要可分为：液固吸附色谱法，液液分配色谱法，化学键合相色谱法，离子交换色谱法和凝胶色谱法(体积排阻色谱法)。各类型的分离原理以及应用如下：模式分离原理液固吸附色谱利用组分在固定相上的吸附能力不同而分离，采用非极性或弱极性流动相，保留值取决于官能团的类型和数目液液分配色谱根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。分配系数较大的组分保留值也较大正相键合相色谱利用组分在极性键合固定相与弱极性或非极性流动相之间分配系数不同而分离，流动相极性增大，保留值降低反相键合相色谱采用非极性键合固定相和以水为底溶剂的极性流动相，利用非极性基团的疏水作用和极性基团在流动相中的二次化学平衡，如形成离子对、手性包络物、酸碱平衡等进行分离离子交换色谱及离子色谱组分离子与固定相平衡离子进行动态交换，根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的凝胶色谱以孔径一定的多孔凝胶为填充剂，样品按照尺寸差异进行分离。小分子保留值大，大分子保留值小。根据孔径尺寸范围不同，有一定的相对分子质量分离范围1.4高效液相色谱法的应用和局限性HPLC具有高压、高速率、高效率、高灵敏度等特点，广泛应用于卫生检验、环境保护、生命科学、农业、林业、水产科学和石油化工等领域，尤其适用于分离、分析不易挥发，热稳定性差的各种离子型化合物。例如，分离分析氨基酸、蛋白质、维生素、生物碱、糖类、农药等，在几百万种化合物中，可分离分析约80%的有机化合物。而其余20%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等相对分子质量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。其局限性主要体现在：HPLC使用多种溶剂作流动相成本高，易于引起环境污染；缺少GC中使用的通用型检测器等。1.5高效液相色谱常用的检测器(1)紫外吸收检测器其最重要的特征是对流动相的脉冲和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱；主要缺点是对无紫外吸收的组分不响应，而对紫外吸收较大的溶剂如苯不能作流动相使用。(2)光电二极管阵列检测器可获得组分的三维图谱，以获得更多信息。(3)示差折光检测器属于通用型检测器，应用较多，主要缺点是对温度变化特别敏感，且不适于梯度洗脱。(4)荧光检测器属于高灵敏度、高选择性检测器，仅对具有荧光特性的物质有响应，对流动相脉冲不敏感，常用于梯度洗脱。1.6高效液相色谱固定相液-固色谱固定相：可分为极性和非极性两大类。极性吸附剂为各种无机氧化物，如：硅胶、氧化铝等；非极性吸附剂最常见的是活性炭。不同类型的有机化合物，在极性吸附剂上的保留顺序如下：氟碳化合物＜饱和烃＜烯烃＜芳烃＜有机卤化物＜醚＜硝基化合物＜腈＜酯、酮、醛＜羟酸。液-液色谱固定相：由两部分组成，一部分是作为载体的惰性颗粒，另一部分是涂在载体表面上的固定液。常用',-氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨烷等。液-液色谱固定相不适合梯度洗脱。化学键和固定相：常用非极性键合相有十八烷基键合相(ODS)、极性键合相有氨基键合相(强极性)、氰基键合相(中强极性)。化学键合相的优点：使用过程不流失；化学性能稳定，在pH2～8的溶液中不变质；热稳定性好，一般在70℃以下稳定；载样量大；适合梯度洗脱。1.7高效液相色谱流动相液相色谱的流动相又称为淋洗液、洗脱液等。流动相的组成、极性改变可显著改变组分分离状况，故改变流动相的组成和极性是提高分离度的重要手段。亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，而疏水性固定液常采用亲水性流动相。按组成不同流动相可分为单组分(纯溶剂)和多组分，按极性可分为极性、弱极性、非极性，按使用方式则有固定组成(恒定)洗脱和梯度洗脱。常用作流动相的溶剂有：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水等。可根据分离要求选择合适的纯溶剂或混合溶剂。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，达到改进分离或调整出峰时间的效果。1.8液相色谱流动相的选择在选择流动相时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时，首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加，也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短，即梯度洗脱。2高效液相色谱在食品中的应用2.1食品中黄曲霉毒素的测定黄曲霉毒素(AFT)是一种毒性极强的真菌毒素，目前已分离鉴定的有近20种，是一类化学结构相似的物质，其中以B1、B2、G1、G2和M1、M2为主。在天然污染的食品中以B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。林裕［3］建立HPLC测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的方法，采用ALLSPHEREODS（250×416mm）色谱柱，流动相为乙腈/水（梯度洗脱），荧光检测器：激发波长360nm，发射波长440nm。结果最低检出的B1、B2、G1、G2分别为浓度0.20μg/kg，0.05μg/kg，0.20μg/kg，0.05μg/kg。样品进行净化、衍生处理后，用荧光检测器检测，检出的浓度比国标法［4］提高10倍。2.2食品中农、兽药残留量的测定为了防止粮食作物和蔬菜水果等的病虫害,往往在它们的生长期内施加一定的农药。这些农药在收获的果实上的残留量就成为人们关注的问题。尤其是有些有机农药对人体健康的危害不能不引起人们的重视。高效液相色诸法提供了分析残留农、兽药量的一种较好的方法。2.2.1蔬菜水果中农药残留量的测定目前蔬菜水果中不同种类农药的残留测定方法主要是气相色谱法(GC)或气相色谱－质谱法(GCMS)，但GC对沸点高或热稳定性差的农药需进行衍生化处理，这样就不可避免地增加了样品前处理的难度，也使它的应用受到一定程度的限制。李永新［5］等建立了同时测定蔬菜水果12种农药残留的反相高效液相色谱分析方法。将样品捣碎，用乙酸乙酯超声提取，经Florisil固相萃取柱净化、正己烷二氯甲烷(1∶1)洗脱、氮气吹干、甲醇溶解并定容后，采用高效液相色谱柱分离、紫外检测，以外标法定量。结果表明：5种有机磷农药、6种拟除虫菊酯类农药和除草剂二甲戊乐灵的检测限为0.114～2.65ng。应用该法对从市场上随机购买的莲白、小白菜、黄瓜等20个蔬菜样品和苹果、梨等20个水果样品进行检测，其中氧化乐果的检出率分别为55%和45%，辛硫磷的检出率分别为50%和30%，由此可见，国家明文规定的不得用于蔬菜、瓜果的剧毒、高毒农药仍有检出。2.2.2肉类中残留兽药量的测定激素是由内分泌腺和散在其它器官的内分泌细胞所分泌的微量生物活性物质，动物和人体内正常时含量甚微，残留于动物性食品中的激素常为性激素，当性激素超过人体正常水平时，会破坏机体的正常生理平衡而呈现不良后果。因此对食品中激素残留的测定十分重要。王帆［6］等研究检测大豆异黄酮类保健食品中三种雌激素(雌二醇、雌酮、己烯雌酚)含量的分析法。采用HypersilODS2Cl8色谱柱，流动相为甲醇水(体积比53∶47)，流速1.0ml/min，检测波长280nm，该方法的线性范围在0.5～250mg/L，三种雌激素的最低检出限分别为0.8、0.9、0.4mg/L。2.3食品中各种添加剂含量的测定2.3.1食品防腐剂的分析测定苯甲酸和山梨酸是食品中最常使用的两种防腐剂。对于它们的分析过去常用分光光度法和气相色谱法进行,但要经过繁杂的预处理操作。近年来发展了高效液相色谱法只需经过简单的处理,就可直接进行测定。我国秦皇岛卫生检验所的赵惠兰等报导了用高效液相色谱法快速测定饮料中苯甲酸、山梨酸的方法［7］。他们将饮料过滤后直接注入液相色谱系统。10—20min可同时测定这两种防腐剂及糖精钠的含量。该法的色谱条件是：以uBandapakC18柱为分析柱，含有0.02M醋酸胺的甲醇水（35：65）溶液为流动相,洗脱速度1ml/min,在254um的紫外检测器进行检测。该法的回收率97%。标准差为0.29，变异系数为0.038。武汉市产品质量监督检验所的周胜银、李增也报导了用高效液相色谱法测定酱油及软饮料类样品中防腐剂的方法［8］。2.3.2测定食品中非食用色素酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O均为工业染料，用于染丝、麻、皮革等，这3种物质均可以使人致癌，根据GB2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》规定，这3种物质严禁作为品使用。但不法商贩利用其颜色鲜艳、着色稳定、价廉的特点非法添加于豆制品中，使腐竹、豆皮的色泽光亮，欺骗消费者，严重危害了广大消费者的身体健康[9]。：建立食品中的酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O染料残留的高效液相色谱同时测定的方法，样品通过提取之后，采用基质固相分散法净化，然后分别用乙醇和乙醇-氨水-水（7∶2∶1）分步洗脱，最后进行HPLC分离、检测。此法的回收率平均为79％，酸性橙Ⅱ的检出限为0.01mg/kg、碱性橙2的检出限为0.02mg/kg，碱性嫩黄O染料的检出限为0.01mg/kg，相对标准偏差平均为3.53％[10]。2.4食品贮藏过程产生毒素的测定一些食品在加工过程中会产生化学变化，生成对人体有害的物质。2002年4月瑞典斯德哥尔摩大学MargaretaTornqvist教授，首次在油炸及焙烤的马铃薯和谷物类食品中发现了具有神经毒性的潜在致癌物——丙烯酰胺(Acrylamide)，该毒物很容易经消化道、皮肤、肌肉或其他途径吸收，并能通过胎盘屏障，是一种公认的神经毒素和准致癌物，已被WHO国际癌症研究中心(IRAC)列为可能致癌物质(ⅡA类)。2005年4月13日我国卫生部发布了“建议全国消费者避免食用油炸薯片和油炸薯条”的公告，呼吁采取措施减少食品中丙烯酰胺可能导致对健康的危害。柳其芳［11］等检测食品中致癌物丙烯酰胺的固相萃取，二极管阵列检测，反相高效液相色谱测定，用水提取食品中丙烯酰胺，采用C18固相萃取小柱对样品液进行纯化，流动相为甲醇水(体积比5∶95)，DAD扫描波长范围190～370nm，检测波长210nm。结果丙烯酰胺在0.1～10mg/L浓度范围内线性良好，方法检出限为10ng/g。用建立的方法分析了59份面包、谷类、豆类、坚果类和土豆类食品，结果显示，食品炸焦的程度越深，则丙烯酰胺含量越高。食品贮藏不当，会引起真菌生长，造成食品的腐败变质，同时有些霉菌产生的霉菌毒素，具有较强的毒性和耐热性。3小结综上所述,