SDS-PAGE操作方法要点

1SDS-PAGE教程1SDS-PAGE原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KDa到200KDa之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K–bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS-PAGE[Laemmli法]这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法，这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多，而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题，而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已，所以阐述如何操作的文字只有那么一小段（但相当经典），这是SDS-PAGE（不连续系统）的首次成功应用。现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其SDS-PAGE时引用Laemmli方法，目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE的基础的确来自Laemmli方法，但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli！2SDS-PAGE各试剂配制方法30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】各种组分名称体积(mL)或质量(g)备注30%Acr-Bis(29:1)100mL实验室配制时用量(100mL)29%Acrylamide(丙烯酰胺)29g29.2g1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺)1g0.8g【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45µm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实pH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。【保存条件】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。1MTris-HCl（pH6.8）(浓缩胶buffer)【组分浓度】1MTris-HCl名称用量备注3Tris12.1g去离子水80ml浓盐酸9ml(36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】称量12.1gTris碱溶于80mL的去离子水，充分搅拌溶解，加约9mL的浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100mL，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。【保存条件】室温保存。【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。1.5MTris-HCl（pH8.8）(分离胶buffer)【组分浓度】1.5MTris-HCl名称用量备注Tris18.17g去离子水80mL浓盐酸3mL(36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100mL后，室温保存【配制方法】100mL称量18.17gTris碱溶于80mL的去离子水中，充分搅拌溶解，加约3mL浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100mL，高温高压灭菌后，室温保存。【保存条件】室温保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS【组分浓度】10%(w/v)SDS名称用量备注SDS1g去离子水8mL加入去离子水定容至10ml后，室温保存【配制方法】称取2g高纯度的SDS置于100~200mL烧杯中，加入约16mL的去离子水，于68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节pH至7.2，定容至20mL后，室温保存。【保存条件】室温保存【注意事项】对人体有害，请注意防护。10%过硫酸铵溶液-----10%(w/v)APS【组分浓度】10%(w/v)过硫酸铵(APS)4名称用量备注过硫酸铵0.1g去离子水1mL现配现用【配制方法】称取0.1g过硫酸铵置于1.5mL离心管，加1mL去离子水吹打溶解，亦可以加倍，即称取1g过硫酸铵，加入10mL的去离子水后搅拌溶解。4℃保存。【保存条件】4℃保存【注意事项】10%过硫酸铵溶液在4℃保存时，可使用2周左右，超过期限会失去催化作用。5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液-----5×Tris-Glycinebuffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）【组分浓度】各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)1000ml500ml0.125MTris15.1g1.25Mglycine(甘氨酸)94.0g0.5%(W/V)SDS5.0g【配制方法】称取15.1gTris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800mL蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000mL，室温保存。得0.125mol/LTris-1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释5倍。【保存条件】室温保存，两年有效。【注意事项】配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用1-2次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液。5×SDS-PAGE加样缓冲液-----5×SDS-PAGELoadingBuffer【组分浓度】0.25MTris-HCl(pH6.8)；10%(W/V)SDS；0.5%(W/V)BPB(溴酚蓝)；50%(V/V)甘油；5%(W/V)β-巯基乙醇(2-ME)或0.5MDTT(二硫苏糖醇)各种组分名称配制用量备注总体积10mL1MTris-HCl(pH6.8)2.5mLSDS1gBPB(溴酚蓝)50mg甘油5mL（0.5mL/份）分装，室温保存，使用前加25μL2-ME/小份，保存一个月左右。β-巯基乙醇(2-ME)0.5mL【配制方法】量取1.25mL1MTris-HCl（pH6.8），0.5gSDS，25mgBPB，2.5mL甘油，置于10mL塑料离5心管中，加去离子水溶解后，定容至5mL，小份（0.5mL/份）分装，于室温保存。使用前将25μL的2-ME加入到每小份中。加入2-ME的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右。【保存条件】-20℃保存，至少一年有效。【注意事项】SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTT或β-巯基乙醇，有轻微刺激性气味，必须完全溶解后再使用。二者作用相似，但DTT的刺激性和毒性都低于β-巯基乙醇，且粉末的稳定性也高于β-巯基乙醇。DTT的最佳工作pH范围为7.1-8.0，但DTT价格略高一些。蛋白巯基还原实验DTT的常用工作浓度是1-10mM。摘自Takara商品目录--实验室常规试剂配制方法TEMED原液直接使用考马斯亮蓝R-250染色液【组分浓度】0.1%(w/v)考马斯亮蓝R-250，25%(v/v)异丙醇，10%(v/v)冰醋酸各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)1000ml备注考马斯亮蓝R-2501.0g可以多加点，最好在摇床上摇摇，多溶解些。异丙醇250mL搅拌溶解，可用甲醇或乙醇替代。甲醇固定效果好，但甲醇难闻且对身体有害。乙醇浓度太大会使胶皱缩。冰醋酸100mL搅拌均匀去离子水650mL搅拌均匀，滤纸快速过滤除去颗粒物，室温保存考马斯亮蓝R250染色，染色时间控制在0.5-1h。（注意：（1）保存考马斯亮蓝R250可回收使用，可保存很长时间，但一般不超过6个月；（2）染色时间过长难以脱色，过短染色效果不佳；）考马斯亮蓝染色脱色液【组分浓度】10%(v/v)醋酸，5%(v/v)乙醇名称用量备注冰醋酸100mL乙醇250mL一般加的量与染色液相同，只是不加R-250去离子水650mL充分混匀后使用脱色（三个小时后应换次脱色液，再重新加入脱色液且约需脱色24小时，直到背景清晰为止）（1）蒸馏水中冲洗2-3次（2）7％冰乙酸固定（3）7％冰乙酸10％乙醇83ml蒸馏水脱色（4）7％冰乙酸保存（要检测脱色后的胶，则需保存于7％冰乙酸中）蒸馏水冲洗→7％冰乙酸（关键步骤），10％乙醇脱色脱色液：7％冰乙酸，10％乙醇，83ml蒸馏水7％冰乙酸保存（蒸馏水冲洗后用7％冰乙酸保存且约二～四天后再照胶，条带更为清晰）。银氨染色用凝胶固定液（质谱用）【组分浓度】50%(V/V)甲醇，10%(V/V)醋酸名称用量备注甲醇500mL6醋酸100mL去离子水400mL充分混匀后室温保存银氨染色用凝胶处理液【组分浓度】50%(v/v)甲醇，10%(v/v)戊二醛名称用量备注甲醇50mL戊二醛10mL去离子水40mL充分混匀后室温保存银氨染色用凝胶染色液【组分浓度】0.4%(w/v)AgNO3，1%(v/v)浓NH3·H2O，0.04%(w/v)NaOH名称用量备注20%AgNO32mL浓NH3·H2O1mL4%NaOH1mL去离子水96mL充分混匀后室温保存【配制方法】取上述试剂加入100~200mL的试剂瓶中，均匀混合。该溶液应为无色透明状。如果氨水浓度过低时溶液会呈混浊状，此时应补加浓氨水直至透明。本染色液应现用现配，不宜保存。银氨染色用显影液【组分浓度】0.005%(w/v)柠檬酸，0.02%(v/v)甲醛名称用量备注柠檬酸50mg甲醛0.2mL去离子水定容至1L后充分混匀，室温保存SDS-PAGE凝胶配方1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶最佳分离范围5%60-212kDa7.5%30-120kDa10%18-75kDa12%12-60kDa15%15-45kDa来源于《蛋白质技术手册》汪家政每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区间7内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）6%胶510152025304050蒸馏水2.65.37.910.613.215.921.226.530%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.05.06.08.010.01.5MTris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.04成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）8%胶510152025304050蒸馏水2.34.66.99.311.513.916.523.230%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.36.78.010.713.31.5MTris,pH8.81.32.53.85.06.37.51012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.2