感染性疾病的实验诊断(2015-7-29)

感染性疾病的实验诊断浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室杨青不适当初始抗菌治疗将导致病死率显著提高不充分初始治疗充分初始治疗Apost-antibioticeraisinsteadaveryrealpossibilityforthe21stcentury-----WHO提高抗感染水平的关键-正确的诊断感染的诊断感染类型，感染部位病原体的诊断获得确切的病原体耐药性的诊断耐药菌的种类耐药机制明确感染性疾病的实验室诊断血清学方法分子生物学方法培养直接镜检法体外药敏试验病例1患者男性，33岁，有18年乙肝病史6.27患者无明显诱因地出现头痛伴发热，体温最高达38.7度，伴全身肌肉酸痛，乏力，胃纳差，恶心6.30在杭州某医院就诊，血常规：白细胞7.4×10E9/L，淋巴细胞3.6×10E9/L，超敏CRP10mg/l，拟诊为“脑炎”，建议患者住院行腰穿，患者拒绝7.1来我院就诊，头颅CT未见异常血培养结果成为诊断的关键7.1血培养：马耳他布鲁菌采血指徵•发热（38C）或低温（36C）、寒战、呼吸快•白细胞增多（计数大于10，000109/L，特别有“核左移”未成熟的或杆状核）、CRP升高•皮肤粘膜出血•血压降低、昏迷、多器官衰竭•血液病：粒细胞减少（成熟的多核白细胞1000109/L）、血小板减少血培养遇到的问题血培养阳性率偏低血培养污染报告时间较长(48–72h)提高血培养阳性率，关键在临床；改善血培养报告质量，关键在实验室影响血培养阳性的关键因素采血时机采血次数接种血液数量皮肤消毒…为什么要采双瓶双侧我院数据每瓶要保证足够的血量JMicrobiolImmunolInfect,2013,46(1):48-520.05.010.015.020.025.030.035.040.02004200520062007200820092010201120122013血液比例痰液比例050001000015000200002500030000350002004200520062007200820092010201120122013血液痰液浙大一院血培养送检情况日期样本号姓名培养结果2014040220140402BAA230鲍加祥培养7天无菌生长2014040320140403BAA214鲍加祥培养7天无菌生长2014040420140404BAA231鲍加祥培养7天无菌生长2014040520140405BAA229鲍加祥培养7天无菌生长2014040620140406BAA214鲍加祥培养7天无菌生长2014040720140407BAA209鲍加祥培养7天无菌生长2014040820140408BAA214鲍加祥培养7天无菌生长2014040920140409BAA206鲍加祥培养7天无菌生长1瓶77%2瓶14%4瓶9%4瓶血阳性21%3瓶血阳性8%2瓶血阳性33%1瓶血阳性38%病例2美平美平+替考美平+替考+米卡芬净特治星+万古+米卡芬净泰能+替加+万古+米卡芬净7.30血培养阴性7.31血培养阴性8.1血培养阴性8.4血培养阴性8.6送检血培养,4.5H报警阳性(下午6点）8.7早上血培养报警阳性，涂片阴性杆菌立即抽取血培养液离心取菌液上机鉴定药敏下午3点鉴定结果大肠埃希菌下午4点药敏结果IMPMIC≥16ug/ml,TGCMIC0.38ug/ml，其余抗菌药物均耐药。PCR证实产NDM-1血标本阳性报警完整报告血培养三级报告－缩短TAT第一天第二天第三天标本质量评估－痰涂片GarbageinGarbageoutLaboratory痰标本的采集方法Manualofclinincalmicrobiology10th监督自然咳痰呼吸道分泌物培养前一定要做涂片！！鳞状上皮细胞、细菌合格标准只有一个：鳞状上皮细胞＜10病例2患者胡某某，女，52，因“发热半月余，胸痛1周”入院（2013.11.11）简要病史：患者半月前出现发热，最高体温40.0℃，1周前感胸痛，深呼吸及咳嗽时较明显，2天前至当地医院就诊，予抗感染治疗，未见明显好转。既往史有溶血性贫血、高血压病史，长期不规则服用激素2013.11.11肺CT：两肺多发结节灶2013.11.14肺增强CT：两肺多发结节伴厚壁空洞，两侧少量胸腔积液，曲霉菌感染首先考虑，恶性病变待排，必要时穿刺活检痰涂片（2013.11.13）涂片报告提示奴卡菌11.202014.1.12.53.5尿培养流程护理人员执行医嘱患者留取标本实验室按规程操作发出报告临床评价医生医嘱大量假阳性少量假阴性与临床符合率太低阴性菌105CFU/ml，阳性菌104CFU/ml1、有无症状2、是否使用抗菌药物3、尿是否在膀胱存留3h以上4、是否为清洁中段尿5、是否2h之内送检6、导尿袋脓液或创面分泌物标本应区分浅表、深部或手术切口皮肤消毒非常关键开放性损伤，无菌生理盐水擦洗病灶表面未溃破的脓肿宜用碘酒、酒精消毒皮肤取材部位最好为损伤基底部或病变有进展的边缘，不可仅为脓液涂片评价标本的质量，快速报告清洁后金葡菌为主清洁前取样数种凝固酶阴性葡萄球菌病例3患者女，55岁，因“肾移植术后半年，反复发热一月余，加剧伴关节痛6天”入院。2月余前，患者因扭伤右脚踝关节，并出现发热，来我院住院治疗，体温基本正常后出院。1月余再次出现发热，入院后予泰能0.5克BID抗感染治疗5天，体温正常出院。患者1月前再次出现发热，体温最高达40度，再次住院治疗，予以可乐必妥500mg静滴抗感染治疗，好转出院。6天前，患者无明显诱因下，右侧踝关节疼痛再发，伴有高热，体温最高达39℃，偶有胸闷，3.26再次于本院就诊入院革兰染色：可见有折光性菌体抗酸染色（4+）血清学诊断方法优点快速报告结果敏感性提高取材简便多以真菌在致病状态产生的物质为检测标志物，结果阳性提示有致病性定量检测可判断感染严重程度及疗效评估•乳胶凝集试验：•以乳胶颗粒作为载体的一种间接凝集试验。即吸附新型隐球菌荚膜多糖抗原于其表面，特异性抗体与之结合后，产生凝集反应•胶体金法：新型隐球菌荚膜多糖抗原检测阴性阳性隐球菌脑膜炎中的应用李娟等报道墨汁染色涂片诊断隐球菌脑膜炎灵敏度61.1％（11/18),脑脊液真菌培养灵敏度38.9％(7/18),隐球菌抗原检测灵敏度100％(18/18)，特异度99.4%(149/150)刘正印等报道墨汁涂片染色阳性23例(23/26,88%)，乳胶凝集试验抗原阳性20例(20/20，100%)，培养阳性8例(8/13,62%)大多数研究报道灵敏度93–100%，特异性93–98%李娟,吕晓菊,等.四川大学学报（医学版）,2010,41(6):1074-1075,1079刘正印,王爱霞,等.中华内科杂志,2002,41(8):541-543肺部隐球菌病中的应用GM试验检测底物：曲霉细胞壁成分半乳甘露聚糖(菌丝在组织生长过程中释放)标本：血清、肺泡灌洗液方法：ELISA双抗体夹心法cut-off值：ODI≥0.5两次ODI≥0.5或一次ODI≥0.7提高阳性预测值GM试验的临床价值血清GM推荐用于恶性血液肿瘤患者和造血干细胞移植患者（未进行抗真菌治疗）早期诊断非粒缺、实体器官移植（SOT）、ICU患者、已开始抗真菌治疗，建议同时测定BALFGM半乳甘露聚糖水平的动态变化反应抗真菌药物疗效，指导抗真菌药物使用47假阳性哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸与真菌成分有交叉反应（组织胞浆菌、皮炎芽生菌、青霉、镰刀霉、头状地霉等）谷类食物中的GM抗原经肠道入血，化疗并且出现严重黏膜炎的患者更容易发生这种吸收G试验检测底物：(1-3)--D-葡聚糖(真菌细胞壁成分50%)标本：血清（无热源采血管），3h内送检方法：比浊法或比色法cut-off值：不同试剂盒不同G试验可检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉、镰刀霉、支顶孢霉、卡氏肺孢子菌，不能检测隐球菌、接合菌G试验的临床价值目前主要用于侵袭性念珠菌和曲霉感染的诊断、高危人群的监测以及对疗效、预后的评价对于区分确诊或拟诊侵袭性真菌感染与非侵袭性真菌感染患者，有良好的准确性连续检测可动态反应真菌感染程度和抗真菌治疗疗效50假阳性污染（试管、枪头、蒸馏水）血液透析、腹膜透析（纤维素膜透析）外科手术使用纱布抗肿瘤多糖静脉制剂（白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子）51动态监测临床应用WBC白细胞计数Endotoxin内毒素IL-6白介素-6IL-10白介素-10TNF肿瘤坏死因子Procalcitonin降钙素原CRPC反应蛋白ProteinCHMG-1sTREM-1........选择合适血清学指标，帮助临床判断感染的类型、严重程度及疗效依据生理生化特征进行鉴定的传统方法面临很多的困难费时，对于分枝杆菌、厌氧菌等需要更长时间广谱抗菌药物的使用极大降低了培养的阳性率苛养和少见细菌感染增加常规的自动化鉴定仪鉴定菌种范围有限，有时无法准确鉴定到种分子生物学技术在临床的应用基于基因扩增及测序技术的快速鉴定蛋白质谱对可培养病原菌的快速鉴定16SrRNA序列测定已成为疑难病原菌检测和鉴定的常用方法Xpert®MTB/RIFXpertMTB/RIF核酸检测采用Cepheid公司GeneXpert检测系统，是一种半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，针对rpoB基因81bp利福平耐药核心区间（RRDR）设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否结核以及是否对利福平耐药（rpoB序列存在突变）。可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单HIV患者Tspot结果阴性GeneXpert检测系统分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测（芯片法）病例4患者男性，72岁，3月前无明显诱因出现咳嗽咳痰，检查“痰找抗酸杆菌+++”，“CT两中肺结核右下肺、左下肺炎”，当地医院诊断“肺结核”，给予“异烟肼乙胺丁醇利福平”抗结核治疗20天后，出现药物性肝损，护肝降酶治疗效果不佳，TBIL进行性升高，2011.4.14“TBIL275.4umol/l”5.16痰找抗酸杆菌抗酸杆菌？结核杆菌？非结核分支杆菌？奴卡菌？痰培养：16sRNAPCR证实为鼻疽奴卡菌痰结核菌培养基因芯片杂交结核分支杆菌阴性鸟分支杆菌阳性鸟分支杆菌的治疗对异烟肼（INH）及吡嗪酰胺（PZA）耐药每周三次给药：克拉霉素或阿奇霉素，利福平、乙胺丁醇，加或不加阿米卡星，治疗6个月AgnèsFerronietal,JCM,2010A.Bizzinietal,JCM,2010基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法MALDI-TOFMS原理：用特异性的多肽、蛋白质谱进行菌种鉴定优势：快速：20min之内即可得到结果，是现有方法中最快的阳性血培养鉴定法、纯菌株大约10分钟高特异性和敏感性：接近100%对部分混合感染样本的准确鉴定不足：多报道用于鉴定细菌，酵母菌及分枝杆菌需要建立严格的标准数据库体系进行比对分析应用范围：纯培养菌株、或报警阳性的血培养瓶检测病例5男性，50岁，因“咳嗽咳痰伴左颊部溃疡3月”入院病例特点：3月前患者无明显诱因下出现阵发性咳嗽咳痰，继而出现恶心呕吐，伴有乏力当地CT：两肺多发感染，两肺多发性弥漫粟粒及小结节影，纵膈、肺门淋巴结多发钙化。当地血培养提示杰氏棒状杆菌，痰培养提示洛非不动杆菌。左下肺穿刺病理提示化脓性肉芽肿性炎（PAS+，六胺银+，形态首先考虑真菌感染）两肺多发团块、结节、粟粒样病灶，以炎性病变（真菌感染）伴左侧胸腔积液首先考虑血培养痰培养常规方法鉴定为杰克棒状杆菌或洛非不动杆菌质谱仪鉴定为马红球菌谢谢聆听，请批评指正！