GFP应用综述

GFP荧光蛋白的应用概述前言：源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP)，是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。绿色荧光蛋白的发现具有划时代的重要意义，它不仅为当代生物学研究提供了极为实用的基本研究手段，并且在此基础上改造发展和发现了一些列荧光蛋白，扩展了应用范围。现就GFP的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。主要内容：1、GFP的具体应用：作为转基因植物和动物的筛选标记用于定位标记跟踪观察微生物发育机理研究用于细胞筛选用于免疫学2、GFP在生物领域的最新应用进展：显像技术失踪技术报告基因生物光学感受器筛选技术抗体生产（1）显像技术由于荧光蛋白有多种颜色，且稳定无毒，所以荧光蛋白可是的动物体内复杂的系统结构可视化。Livet等用多种不同的颜色的荧光蛋白对神经系统进行了基因标记，使得我们能够观察到大脑的集成路线图，可以直观地看到神经细以及细胞间的相互作用。另外，荧光蛋白还可用于生物发育领域，能够形象的观察生物体的器官组织结构的变化，随着发育学研究的深入，荧光蛋白必将成为强有力的工具。（2）失踪技术一般的荧光染料标记的微生物，由于其生长快、分裂快，染料可在短时间内被稀释，所以不能实时准确地观察微生物侵入活体动物以及细胞的过程。近年发现，荧光蛋白可用于失踪流行性病毒对活体细胞的感染，流行性病毒可被实时监控，借助这一新技术，可以更深入地研究其感染方式。Zhao等发现用GFP标记细菌，可以详细的对细菌的入侵进行时空检测，以确定细菌特异性的感染部位以及传染源的空间位移。GFP克服了一般荧光染料所带有的缺陷，GFP必将会进一步取代一般的荧光染料，有效地帮助学术研究者观察分析细菌病毒的感染方式。（3）报告基因由于荧光蛋白发光团的形成不具有物种专一性，可发出荧光稳定，且不需要依赖任何辅因子或其他基质而发光，所以转入宿主细胞后的荧光蛋白基因很稳定，对多数宿主的生理无影响，是理想的报告基因。荧光蛋白作为报告基因，可显示生物体1个或多个基因的表达的状况，并可对活体细胞内的蛋白运动和细胞件间的互作进行实时荧光显像，且直观、准确。Gregor等构建了bicoid与GFP的融合蛋白，通过直接光漂白和间接对bicoid扩散常数的估测，使研究者能直接地观察到bicoid输送的实时影像，帮助研究者更好地了解bicoid成形梯度的稳定性和核动态。（4）生物光学感受器荧光蛋白由于其独特的光信号转导机制，适于用作细胞内的光学感受器。现在许多研究者将具有信号转导功能的分子识别位点结合到荧光蛋白上来设计成生物感受器。经研究发现，利用ＧＦＰ感受器可以检测多种分子（如核酸，激素）的表达状况，甚至可以检测活体细胞中蛋白质的构象变化，其潜在应用前景极为广阔。Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等构建了一种黄色荧光蛋白融合库作为单分子感受器，可以有效用于分析大肠杆菌单细胞总蛋白质和ｍＲＮＡ表达水平的关系。（5）筛选技术利用ＧＦＰ可显色的特点，我们可以对需要的物质就进行筛选和纯化。可用于检验玉米胚乳和胚芽提取物的筛选和纯化重组蛋白的效力。（6）抗体的生产Ｓｔｅｅｌａ等将新型病毒——葫芦黄发育迟缓病毒外壳蛋白植入ＧＦＰ基因，并转入农杆菌，再将农杆菌接入本生烟用于生产该病毒，然后再利用ＧＦＰ纯化的重组蛋白便可制备多克隆免疫抗体。快速灵敏的ＧＦＰ抗体生产技术在应对新型流行病毒、及时控制疫情等方面必定会发挥巨大的作用。（7）益生菌在动物胃肠道中的动态检测现在ＧＦＰ已经应用于饲用益生菌的动态检测，并且表现出来良好的研究和应用前景。利用ＧＦＰ失踪技术，可以直观的观察到ＧＦＰ重组菌在肠道黏膜中的定值、在局部区域的繁殖以及扩散到整个肠道的过程，是整个动态过程可视化，这对研究益生菌的益生机制提供了有力的技术。边慧慧等首次采用带有ＧＦＰ质粒的大肠杆菌作为蛋白质指示剂，简单、直观、形象地指示了鱼类摄食后不同时间食糜蛋白在消化道内的分布状况。同时，利用ＧＦＰ还可以通过测定黏膜上皮细胞、组织的荧光强度初步估计蛋白质的消化吸收情况。采用ＧＦＰ观测营养物质在胃肠道内的流通与变化，使得抽象的营养消化与吸收变得清晰、具体。（8）水生环境检测人类的生产、生活活动对环境的影响逐渐增强，水的污染日益严重，污染物大多来自工业废物和污水。被污染的水对鱼体的影响表现生殖机能障碍、雄性鱼体雌性化等。人们已经将生物传感器的敏感元件来检测污染水平。研究发现可通过将ＧＦＰ基因重组到可与水中污染物发生反应的启动子中。有研究表明，ＧＦＰ作为报告基因能够被用来作为转基因有机体连续的定性生物传感器测定水中污染物的水平，并在消除酶或特异性蛋白质试验时，提供快速而有效地结果。(9)酶活测定Ｍａｌｉｋ等发现利用ｅＧＦＰ作为底物，通过测定荧光强度可以测定住的胃蛋白酶活性。这种方法有助于准确、直观测定动物肠道内容物消化酶的体外消化能力。3、GFP在肿瘤研究中的应用（1）GFP在肿瘤发病机制研究中的应用GFP是一个分子量较小的蛋白，易于其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。在肿瘤的形成过程中，增值和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受调控相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因，并与正常组织进行比较，若过表达，则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；反之，为促进肿瘤细胞凋亡的基因。肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现，其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用ＧＦＰ的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。（2）ＧＦＰ在肿瘤发生发展研究中的应用研究肿瘤生长、浸润和转移的传统的方法是将载瘤动物分阶段处死，做成光学或免疫组化切片进行观察，或采用ＣＴ、ＥＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ等影像仪器进行检测。为了详细了解肿瘤的生物学行为特征，即使使用大量的动物和昂贵的设备，也难以对肿瘤细胞的生长、瘤体形成过程进行连续、动态的观察。曾有报道将标记了荧光染料的肿瘤细胞经血管注射到动物体内，研究转移病灶形成过程，但由于标记后肿瘤细胞的荧光信号很易衰减，加上肿瘤细胞分裂，通常２～３ｄ后便难以显示或跟踪经荧光标记过得肿瘤细胞。（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ——全反射荧光成像系统）实验初步显示，荧光的强弱与肿瘤大小、深度有关，肿瘤位于皮下０.５ｍｍ，可检测到最小瘤灶为５９ｕｍ；深部的肿瘤，其所发出的的荧光由于受周围组织尤其是皮肤的干扰，小的瘤灶难以显示。为此，ｙａｎｇ等在预检测的器官做一个可逆性的皮瓣，观察时打开皮瓣，建立一条荧光通路，大大提高了检测的敏感性，从而可检测出脑内、肝内单个肿瘤细胞，以及由数个肿瘤细胞形成肺内微小瘤灶。（3）GFP肿瘤在检测肿瘤血管形成方面的应用肿瘤血管形成是肿瘤生长、浸润和转移的必备条件，如果没有新生血管供应营养，肿瘤达到1~2mm的直径将不在增大。因此，测定肿瘤内微血管密度（MVD），可以判断患者预后，通常测定MVD的方法是以抗血管内皮细胞抗体显示血管，计数阳性染色的新生血管数目。由于切片固定和脱水过程中可出现组织体积和形状的改变，采用免疫组化法获得的MVD值可靠性较差。（4）GFP在抗肿瘤药物筛选中的应用GFP作为一种报告基因，转染肿瘤细胞后，将随着肿瘤细胞的分裂、生长而传给下代，也将随着肿瘤细胞的死亡而消亡。根据这一特性，人们已将GFP应用于抗癌药物的疗效评价、肿瘤耐药机制的研究。Chambers等将GFP转染卵巢癌细胞SKOV3，在筛选的阳性细胞内加入抗癌药物阿霉素，结果大部分肿瘤细胞荧光消失，并且证实失去荧光的肿瘤细胞均已死亡。随后的体内实验结果也与体外实验一致。感受：通过查看阅读资料文献，GFP荧光蛋白的应用前景非常广泛，涉及环境、食品、医药各个领域。其中我最感兴趣的是GFP在肿瘤中的研究、GFP在肿瘤基因治疗中的应用。肿瘤基因治疗的关键在于目的基因的高效转染和表达。以往常采用β2半乳糖苷酶、荧光素酶检测目的基因的转染和表达效率,但两者均有明显的缺陷。GFP具有性能稳定、无需底物、能在活体内连续检测的特性,并已成为检测目的基因转染效率和表达方式的最佳报告基因[20]。Flotte等[21]为了探索原位动态检测目的基因转染效率的方法,将Ad2CMV2GFP、AAV2CMV2GFP分别注入新西兰大白兔的支气管内,于转染后的第13、21、30天,采用改装后能够检测绿色荧光的纤维支气管镜进行观察,并于第30天时处死动物行免疫组化对照分析,结果显示GFP能够准确地检测目的基因的转染效率。自杀基因治疗近年来在肿瘤细胞治疗策略中倍受青睐。其原理为将GFP基因与目的基因转染肿瘤细胞,使无毒性前体药物转变为毒性产物而杀死肿瘤细胞,利用GFP的荧光特性,可定量检测和分析载体的转染表达效率[12]。综上所述,GFP具有无毒、性能稳定、无需底物或辅酶和能在活体内动态观测等特性,为研究肿瘤的发病机制、生物学行为、血管形成以及评价抗癌药物的疗效和基因转染效率提供了一种简便可靠的观察方法。我觉得能否用质粒转基因的方法来进行研究。参考文献：绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用——作者：吴沛桥，巴晓革，胡海，赵静绿色荧光蛋白在抗肿瘤药物研究中的应用_——杨华瑜绿色荧光蛋白（GFP）在肿瘤及干细胞研究中的应用——鼓楼医院肿瘤中心GFP绿色荧光蛋白的应用前景绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展GFP荧光蛋白的应用概述现科院生技1102班史晓萌2011614050516•PCR扩增的基本方法BSA在内切酶的缓冲液的作用有三个。1.BSA是酶的稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附;2.BSA能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的至于作用机理我不是很清楚，可能是因为它结构中有34个二硫键，和一个巯基，巯基的化学反应很活泼，二硫键有抗氧化还原的作用，因此可与多种阳离子，阴离子和小分子结合;3.BSA能防止酶吸附到管壁而损失。BSA一般做为稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，因为有些酶在低浓度下不稳定或活性低。加入BSA后，它可能起到“保护”或“载体”作用，不少酶类添加BSA后能使其活性大幅度提高。不需要加BSA的酶加入BSA一般不会受到什么影响。对多数底物DNA而言，BSA可以使酶切更完全，并可实现重复切割。在37℃，酶切反应超过1h时，BSA可以使酶更加稳定，因为在不含BSA的反应缓冲液中，许多限制性内切酶在37℃下只能存活1020min甚至更短的时间。而BSA可以结合缓冲液或底物DNA中抑制限制性内切酶活性的金属离子和其它化学物质。•PCR反应的成分和作用总体积：一般为25μl～100μl（一）无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。（二）Mg2+:终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2+能影响反应的特异性和产率。