第七章-非水相酶催化

EnzymeEngineering酶工程EnzymeEngineering第八章非水相酶催化EnzymeEngineering第一节非水酶学概述一、背景20世纪60年代发现几种酶在有机溶剂中仍具有活性。1984年，A.M.Klibanov在Science上发表“EnzymaticCatalysisinOrganicMediaat100℃”传统的生物催化必须在水溶液中进行的酶学概念发生了革命性的变化。EnzymeEngineering第一节非水酶学概述Enzymaticcatalysisinorganicmediaat100℃猪胰脂肪酶在不同溶剂中加热后酶活性的改变溶剂1：水或0.1,mol/L磷酸缓冲液；溶剂2：2mol/L戊醇、三丁醇甘油酯（含0.8%水）；溶剂3：2mol/L戊醇、三丁醇甘油酯（含0.015%水）；EnzymeEngineering第一节非水酶学概述二、酶催化反应的介质非水介质（一定量的水）有机介质超临界流体气相介质离子液介质水介质研究热点：介质工程，溶剂工程。EnzymeEngineering第一节非水酶学概述三、非水介质酶催化反应的特点（1）非极性底物溶解度高，酶易回收和再利用。（2）改变反应平衡，催化在水中不能进行的反应。（3）抑制依赖于水的不利反应和副产物。（4）产物易分离纯化。（5）热稳定性和储存稳定性增加，可减少微生物污染。（6）控制底物的特异性、区域选择性和立体选择性。（7）有机溶剂的凝固点远低于水，使一些对温度敏感的酶可在适宜的温度下进行反应。EnzymeEngineering第一节非水酶学概述有机介质酶反应的应用现状EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应一、酶促反应的有机介质体系低水体系(A)高水分含量体系(B、C、D)ADCBEnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应1、低水体系1）与水互溶的有机溶剂-水单相体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。这种反应体系主要适用于在单一水溶液中溶解度很低、反应速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。2）非极性有机溶剂-水两相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂相所组成的两相体系。反应一般发生在水相或者是两相的界面上。EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应2、高水分含量体系1）非极性有机溶剂-酶悬浮体系底物分子以扩散形式通过酶分子表面的水层进入活性中心，完成催化后再扩散进入有机相2）非极性有机溶剂－PEG修饰酶单相体系3）反胶束体系酶底物产物有机溶剂界面酶底物产物有机溶剂界面底物产物酶有机溶剂界面底物产物酶有机溶剂底物产物酶酶有机溶剂界面EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应二、有机介质中酶促反应的影响因素（一）水对有机介质中酶催化反应的影响1.水对酶分子空间构象的影响只有与酶分子紧密结合的一层左右的水分子对酶的催化活性是至关重要的，这些对于维持酶活性所必需的最低水量称为必需水，又称结合水。EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应2.水对酶催化反应速率的影响催化速度达到最大时的含水量称为最适含水量。低水催化体系中酶活性与含水量之间的关系最适含水量会随着有机溶剂的类型、酶活性位点的极性、酶是否修饰、修饰剂的种类以及反应条件等的变化而不同。一般情况下，最适含水量随溶剂极性的增加而增加。EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应水活度（aw）是指在一定的温度与压力下，反应体系中水的蒸气压与同样状态下纯水蒸气压的比值。水活度是确定酶结合水的多少的一个参数，可以很好的表征酶分子表面水含量的多少以及水对有机相中酶催化反应的影响。当体系的含水量一定时，溶剂的亲水性越强，aw值也越小，酶的活性越低。在含有不同底物的各种有机溶剂中，酶的最适aw一般都在0.55左右，酶的最适aw与溶剂的极性、底物的性质及浓度无关。EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应脂肪酶活性与水活度的关系EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应3.水对酶催化反应平衡及立体选择性的影响调节有机介质反应体系水的活度，可调节反应的平衡点在含水量很低很窄的范围内，随着水活度的增加，酶对对映异构体的选择性增加。含水量继续增加，选择性下降。EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应4.有机介质反应体系中水含量的调控（低水体系）（1）反应前，控制加入的水量。（2）将酶、底物和溶剂分别在饱和盐溶液所形成的气相环境中进行预平衡。（3）向反应体系中通入一定含水量的惰性气体或空气来调节体系的含水量。（4）添加干燥剂控制水分的含量。（5）渗透蒸发法。EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应渗透蒸发法调控水分的原理EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响1.有机溶剂对酶活性的影响有机溶剂直接与酶分子周围的水相互作用，造成酶分子必需水的变化和重新分配，从而影响酶的构象和活性。溶剂的极性越强，对酶活性影响越大。溶剂的疏水性越强，酶在该介质中的反应活性愈高。度有机溶剂在水中分配浓浓度有机溶剂在辛醇的分配lglgPEnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应当溶剂logP4时，酶能保持活性和高稳定性，如（丁醇）。当溶剂2logP4时，酶活性难预测，如（氯仿）。当溶剂logP2时，酶易于发生变性失活，如（甲醇等）。EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应2.有机溶剂对底物和产物分配的影响有机溶剂极性过强，造成酶分子必需水层的脱去，同时造成疏水性底物在溶剂体系中溶解度降低，使酶促反应速度降低。有机溶剂疏水性过强，疏水性底物在溶剂中的浓度高，但很难进入到酶分子必需水层，进入活性中心的底物分子浓度低，而降低反应速度。3.有机溶剂的结构对酶促反应的影响4.有机溶剂的选择溶剂极性强弱、反应平衡、主反应影响、成本、毒性EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应（三）pH对有机介质中酶催化的影响有机溶剂中的酶能够保持其冷冻干燥前或沉淀前所在缓冲液中的pH值，这种现象称为pH记忆。EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应（四）固定化对有机介质中酶催化的影响1两相催化体系中可使酶分子处在水相中，避免变性。2固定化载体疏水性越强，有利于酶活性的保持3可使酶改善分散程度，减少底物或产物的扩散限制。4载体性质会影响到酶在有机介质中的反应动力学。5固定化可提高酶在有机介质中的操作稳定性。EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应012345650100酶活力CLECs（辛烷）冻干酶（辛烷）CLECs（乙腈）冻干酶（乙腈）时间（天）012345650100酶活力CLECs（辛烷）冻干酶（辛烷）CLECs（乙腈）冻干酶（乙腈）时间（天）枯草杆菌蛋白交联酶晶体与冻干酶在己烷和乙腈中的稳定性EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应（五）酶的形态对有机介质中酶催化的影响非水介质体系中酶的主要存在形式：①以固体酶粉的形式悬浮在有机介质中②酶结合在固定化载体上悬浮在有机介质中③修饰酶溶解在有机溶剂中④两相催化系统中，酶溶解在水相⑤以交联酶晶体或交联酶聚集体的形式悬浮在有机介质中（六）温度对有机介质中酶催化的影响在低水有机介质体系中，酶的最适温度比在水溶液中的最适温度高温度也会影响酶的选择性，一般在较低的温度，酶的立体选择性高EnzymeEngineering第二节有机介质中的酶促反应（七）添加物对有机介质中酶催化的影响在有机介质反应体系中，加入甘油、甲酰胺、多羟基化合物可提高酶分子在有机溶剂中的稳定性和催化活性。这些溶剂称为仿水溶剂，一般为强极性有机溶剂。添加盐类也可改变酶的催化速度，因为盐可以改变酶分子表面的离子化状态。在制备有机介质催化用酶时，加入一些有机物或无机物可提高酶在有机介质中的催化速度。氯化钾、PEG在有机介质反应体系中，一定浓度的变性剂可增加酶的催化活性。盐酸胍EnzymeEngineering第三节有机介质中酶的性质一、有机介质体系中酶活性的变化一般来说，酶在有机溶剂中的活性比在水溶液中要低得多。原因：1.传质障碍；2.有机溶剂增加酶促反应的活化能；3.酶分子活性中心刚性的增加。EnzymeEngineering第三节有机介质中酶的性质二、酶的稳定化变化酶在有机溶剂中的稳定性比在水溶液中的稳定性显著提高。1.热稳定性提高；2.储存稳定性提高；3.对变性剂的稳定性。EnzymeEngineering第三节有机介质中酶的性质三、pH记忆和分子印记酶分子记忆原来在水相中的一些特性的现象，称为分子印记。利用酶在有机溶剂中具有分子印迹这一特性，可用来作为提高或改变有机介质中酶专一性（选择性)的有效手段。如配体印迹酶。抑制剂酶蛋白冻干除去抑制剂有机溶剂水溶液抑制剂酶蛋白冻干除去抑制剂有机溶剂水溶液枯草杆菌蛋白酶的分子记忆EnzymeEngineering第三节有机介质中酶的性质四、底物专一性的改变1.酶催化的相对专一性的变化极性较强的溶剂中，疏水性较强的底物易发生反应，反之亦然。有机溶剂中，酶偏向于作用小分子底物。2.立体异构选择性的变化溶剂疏水性增加，酶的立体选择性降低。立体选择性还随底物的不同而变化。EnzymeEngineering第三节有机介质中酶的性质3.区域选择性的变化在酶促反应中，底物某一位置上的基团被酶转化，而另一位置上的相同基团不被转化，这种现象称为酶的区域选择性。4.前手性选择性的变化前手性选择性是指酶催化非手性底物选择性地形成具有一定立体构型的产物。溶剂的疏水性增加，前手性选择性降低。脂肪酶催化1,4-二丁酰基-2-辛基苯与丁醇之间的转酯反应EnzymeEngineering第三节有机介质中酶的性质五、反应平衡方向的移动在有机介质反应体系中，有机溶剂可明显改变反应的平衡，甚至可以使一些反应发生逆转。脂肪酶水溶液脂肪酶有机溶剂酯的水解转酯反应X为O或者NH脂肪酶水溶液脂肪酶有机溶剂酯的水解转酯反应X为O或者NH脂肪酶在水相和有机相中催化的反应EnzymeEngineering第三节有机介质中酶的性质六、酶促动力学的变化酶在非水介质中的催化反应符合米氏方程。底物的种类、溶剂的性质都会影响动力学参数。非水介质中的最大反应速度较水中明显降低。EnzymeEngineering第四节气相和超临界介质的酶促反应和应用（自学）EnzymeEngineering第五节非水相酶催化的应用一、手性药物的制备例如，反应停是一种外消旋体的手性药物，其(R)-异构体具有镇静作用，而(S)-异构体则具有致畸功能。EnzymeEngineering第五节非水相酶催化的应用二、生物表面活性剂的合成生物表面活性剂是指利用酶或微生物通过生物催化和生物合成方法得到的具有表面活性的物质，如糖脂类、氨基酸类、蛋白类等表面活性剂。生物表面活性剂具有优良的表面性能，抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理作用。特点是无毒，可完全降解，不会造成环境污染。通过酶在非水体系中催化合成的生物表面活性剂主要有单甘酯、糖酯、磷脂、氨基酸型表面活性剂等。EnzymeEngineering第五节非水相酶催化的应用三、生物柴油的生产生物柴油是指利用甘油三酯或脂肪酸与短链醇(多为甲醇)进行酯交换或酯化反应制备的脂肪酸单酯，目前商品化的生物柴油的主要成分是脂肪酸甲酯。生物柴油具有环保和可再生性两个突出的优点。生物柴油生产制造过程EnzymeEngineering第五节非水相酶催化的应用四、功能高分子材料合成近年来，人们利用酶催化的底物专一性、区域选择性和立