膜片钳技术的基本原理

膜片钳技术的基本原理膜片钳技术运用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆[gigaohmseal,1010欧姆（GΩ）]以上的阻抗使之对接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（膜片）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行检测记录。膜片钳技术的原理及应用（综述）Intro：细胞是构成生物体的基本单位。细胞内和细胞之间的信号传导的重要途径是通过镶嵌在细胞膜上的离子通道蛋白进行的。1976年，德国的两位细胞生物学家埃尔温.内尔（ErwinNeher）和贝尔特.萨克曼（BertSakmann）建立了一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一或多数离子通道分子活动的技术，成为膜片钳技术（PatchClamp）。这一技术使对细胞电活动的研究精度提高到1pA的电流分辨率，1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率水平，是细胞和分子水平的生理学研究领域的一次革命性突破。它与基因克隆技术（GeneCloning）并驾齐驱，推动了生命科学研究的迅速发展。为此，1991年的诺贝尔医学与生理学奖授予了这两位学者，以表彰他们的突出贡献。这一能精确描述细胞通道特征的实验方法在问世后的短短十几年时间里，已经在生物学研究领域显示出了非常重要的意义和广阔的应用前景。一.膜片钳技术的基本原理膜片钳技术运用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆[gigaohmseal,1010欧姆（GΩ）]以上的阻抗使之对接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（膜片）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行检测记录。（如图1）图1膜片钳技术原理图Rs是与膜片阻扰相串联的局部串联电阻（或称入路阻扰），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1-5MΩ，若Rseal高达10GΩ以上时成为Ip/I=Rseal/（Rs+Rseal）-1，此Ip可作为在I-V转换器（点线）内的高阻扰反馈电阻（Rf）的电压下降而被检出。实际上这时场效应管运算放大器（A1）的输出中包括着膜电阻成分，这部分将在通过第二级场管效应运算放大器（A2）时被减掉。用场效应管运算放大器（图1-A1）构成的I-V转换器[converter，即膜片钳放大器的前级探头（Headstage）]是整个测量回路的核心部分。在场效应运算放大器的正负输入端子为等电位。向正输入端子施加指令电位(CommandVoltage,VCMD)时，由于短路负端子和膜片都可等电位地达到钳制的目的，当膜片微电极尖端与膜片之间形成10GΩ以上封接时，其间的分流电流达到最小，横跨膜片的电流（I）可全部作为来自膜片电极的记录电流（Ip）而被测量出来。（如图1）二.膜片钳技术的各种模式图2是表示膜片钳技术各种模式（mode）的示意图。首先建立的单通道记录法（SingleChannelRecording）是细胞吸附模式（Cell-attachedMode），其后又建立了膜内面向外（Inside-out）和膜外面向外（Outside-out）的模式。后来又建立了开放的细胞吸附式膜内面向外（Opencell-attachedinside-outmode）和穿孔囊泡膜外面向外（Perforatedvesicleoutside-outmode）模式。全细胞记录法是在常规方法的基础上附加穿孔膜片（perforatedpatchmode）的模式。1.单通道记录法-细胞吸附模式（Cell-attachedMode）微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。该方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小，能准确反映通道的活动状态并对此进行客观分析。但缺点是电流小，分辨率地，对技术要求高，难度较大，且工作量大而成功率又较低。2.全细胞记录法在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。该方法的优点是电流大，信噪比好，既可以做电流钳制又可以做电压钳制，且可以改变细胞内容物。但此法只能用于直径小于3μ的细胞，且仅能观察膜电流的变化，不能分析变化的产生机制。3.外面向外（Outside-out），内面向外（Inside-out）模式这两种技术分别是在细胞吸附式和全细胞记录的基础上改进而成，优点是可以分别观察化学因素对细胞膜内侧面和外侧面结构的影响。三.膜片钳技术在植物生理方面的应用1.用膜片钳技术测定植物原生质体膜电位原生质体是研究植物细胞膜特性的适宜材料。由于对原生质体不必考虑细胞比的自由空间等因素，故更便于定量分析膜调节的各种细胞代谢活动。如H+，矿质离子，物质流及植物激素的运输和作用方式等。这类研究的一个重要参数就是膜电位。常规的植物细胞膜电位测量方法是插入法。该方法是将微电极插入细胞进行测量，故容易使细胞造成较大的损伤，尤其是没有细胞壁保护的原生质体更是如此。而且微电极边缘与伤口不能严密封接，导致较大的漏电流产生，易使膜电位去极化，影响测量结果。所以为了提高可靠性，此法只能用于直径达的植物细胞。而高等植物细胞直径都较小，故很难获得可靠的结果。用膜片钳技术的全细胞法就可以解决这一难题。如前文中的原理所述，该方法与插入法相比对细胞的伤害小，只限于管口范围内（管口直径为1-2μm）。而且由于高阻封接，漏电流很小，所以测得的结果要可靠得多。例如，用膜片钳技术测定烟草或小麦的原生质体膜电位时，将直径为1.5-1.8mm，中央带有纤维的玻璃毛细管拉制成2-3cm长，尖端直径1-2μm的玻璃微吸管，并作热抛光。用时注入充灌液（140mmol/LKCl，2mmol/LMgCl2,1mmol/LCaCl2,10mmol/LHEPES-KOH,11mmol/LEGTA-KOH,pH5.2）,微吸管电阻4.3MΩ（0.03MΩ，n=100），封接电阻（0.06MΩ，n=100）。微吸管和压力调节装置固定在显微操纵器上，吸管中Ag/AgCl2电极与BMA-7101双路微电极放大器连接。测量时，先加一负压，使微吸管吸牢原生质体，再加一脉动负压吸破质膜随即读数。以拟南芥ArabidopsisthalianaColumbia根为材料,利用膜片钳技术测定其根细胞原生质体质膜内向K+电流,并对Na+对其K+电流的影响进行的研究发现，Na+可明显抑制拟南芥根细胞原生质体的内向K+电流；外施Ca2+可缓解Na+对内向K+电流的抑制。说明Ca2+参与了质膜上K+通道对K+，Na+的选择性吸收的调节，从而使植物适应盐胁迫。2.用膜片钳技术研究植物细胞质膜的离子通道离子通道是生物膜上由蛋白质大分子组成的孔道,它属于膜蛋白分类中的B型蛋白质,通常由几个跨膜的大亲水区构成,可为化学或电学方式激活或抑制,从而控制离子通过膜的顺势流动,在跨膜离子梯度的形成和维持以及信号转导等生理过程中起着非常重要的作用。自从在蚕豆保卫细胞膜上发现植物离子通道以来,人们对植物细胞乃至作为细胞器的液泡膜上离子通道的认识迅速深入。用膜片钳技术研究蚕豆保卫细胞质膜上的钾离子通道时发现，在一部分细胞的质膜上存在有高通导性的阳离子通道。无论在全细胞记录法还是但离子通道记录水平都得到了类似结果。全细胞记录法表明这些高通导性的阳离子通道为钾离子通道。在膜电位为-180mV时，通过具有高通道性阳离子通道的保卫细胞整个质膜的内向钾电流约为1.5-2.5nA，而通过一般保卫细胞整个质膜的内向钾电流约为0.3-0.5nA。但离子通道记录显示，一些分离膜片上存在高通导性的内向阳离子通道。当膜电位为-118mV时，该内向阳离子通道的通导性约为一般内向钾离子通道的通导性的5倍。这些具有高通导性阳离子通道的特殊保卫细胞的存在可能与逆境条件下气孔的快速效应机制有关。3.用膜片钳技术研究高等植物液泡离子通道液泡是成熟植物细胞和许多真菌、藻类(原核细胞除外)的重要组成部分。中央大液泡是植物的贮存库,占细胞总体积的90%以上。膜片钳技术的研究表明,许多离子和代谢物通过离子通道和离子泵跨液泡膜运送。Pantoja等应用膜片钳技术在景天科酸代谢植物和甜菜液泡上发现了苹果酸渗透的液泡阴离子通道,此后,在拟南芥液泡上也发现了该通道。它具有强烈的内向整流性质,是一种慢激活的通道;只有在负的生理膜电位时才能被激活;内液中的Cl-可以降低开放几率,从而抑制通道电流,但这并不影响单通道的电导;值得注意的是,外液中Ca2+的浓度和ATP都不影响VMAL通道。通道对于MAL-具有极高的选择性,此外,拟南芥中,其它二价有机阴离子如琥珀酸离子和延胡索酸离子也具有与MAL-相当的通透能力,而草酸乙酰离子的通透能力相对较弱;在甜菜液泡上,也有文献报道称NO-、Ac-和H2PO4-能够部分通过该通道。VMAL通道是使MAL-被吸收而进入液泡内的一种途径,但它却不能通过此通道从液泡中流出,后者采取的途径还有待于进一步研究。