ImageJ在荧光照片分析中的应用介绍

ImageJ在显微成像中的应用介绍1、关于ImageJImageJ是一个基于java的公共的图像处理软件，它是由NationalInstitutesofHealth开发的。可运行于MicrosoftWindows，MacOS，MacOSX，Linux，和SharpZaurusPDA等多种平台。其基于java的特点，使得它编写的程序能以applet等方式分发。ImageJ能够显示，编辑，分析，处理，保存，打印8位，16位，32位的图片，支持TIFF,PNG,GIF,JPEG,BMP,DICOM,FITS等多种格式。ImageJ支持图像栈（stack）功能，即在一个窗口里以多线程的形式层叠多个图像，并行处理。只要内存允许，ImageJ能打开任意多的图像进行处理。除了基本的图像操作，比如缩放，旋转，扭曲，平滑处理外，ImageJ还能进行图片的区域和像素统计，间距，角度计算，能创建柱状图和剖面图，进行傅里叶变换。下载地址：、Image界面界面分为：菜单栏，工具栏和状态栏。菜单栏菜单栏从左至右分别是：文件，编辑，图形，处理，分析，插件，窗口，帮助。文件和officeword等软件类似，主要有文件打开，关闭，保存等功能，比较特殊的一个功能是恢复功能（revert），可以直接回到上次保存过的状态。由于编辑菜单里的取消功能（undo）只能回退一步，所以revert有时会很有帮助。编辑Undo,Cut,Copy,Copytosystem,Paste,PasteControl..,Clear,ClearOutside,Fill,Draw,Invert,Selection,Options.图像Type（可改变图片格式，如彩色变灰度）,Adjust,Showinfo,Properties,Color,Stacks,Hyperstacks,Crop,Duplicate..,Rename,Scale,Transform,Zoom,Overlay,LookupTables.处理Smooth,Sharpen,FindEdges,FindMaxima,EnhanceContrast,Noise,Shadows,Binary,Math,FFT,Filters,Batch,Imagecalculator,SubtractBackgroud,RepeatCommand.分析Measure,AnalyzeParticles,Summarize,Distibution,Label,ClearResults,Setmeasurements,SetScale,Calibrate,Histogram,PlotProfile,SurfacePlot,Gels,Tools.窗口和帮助工具栏工具栏从左至右分别是4种区域选择工具，直线选择工具，角度工具，点工具，魔棒，文字，放大镜，拖手，颜色吸管，动作宏，菜单宏，绘图工具等（颜色吸管以后的内容可以变化，通过点击最右边的按钮选择需要的栏目。不同的按钮可以进行测量，画图，标记，填充等操作。双击左键或单击右键可以扩展按钮的功能，如双击文字可以选择字体和大小等。4种区域选择工具分别是方形，椭圆形，多边形和任意形状。选择之后，这些区域可以进行改变，分析，拷贝等。工具栏下的状态栏可以显示坐标信息。直线工具：可以画直线、分段或任意形状的线（右键选择线的类型），双击该按钮可以改变直线的宽度。选择分析测量Analyse→Measure(orCtrl+M)可以记录线的长度，使用Edit→Draw(orCtrl+D)可以使直线永久保留。角度工具：点击角度按钮后可以画相交的直线可以测量形成的角度，在状态栏可显示，选择分析测量Analyse→Measure(orCtrl+M)，在结果窗口中显示角度。点工具：当自动测量（Auto-Measure）开启（默认是开启状态）时，可以在状态栏显示图标所在位置的坐标和亮度，也可点击某点，选择分析测量Analyse→Measure(orCtrl+M)，可以在结果窗口显示上述指标。如果是RGB图，显示红色，绿色和蓝色的亮度（0-255），如果是灰度图片，根据选择图片格式8位（8bit）或16位（16bit），数值不同。8位最大值255，16位为65535（图片格式知识可见下述小知识栏）。魔棒：魔棒工具和photoshop里的类似，可以自动发现目标的边界并勾勒出形状。当图像明暗对比明显时尤为有用。有时可配合阈值(Thresholding)使用。文字：双击文字按钮可以选择字体和大小。单击按钮并按住左键拖出文本框，可以键入需要的文字，文字颜色使用颜色吸管来选择。Edit→Draw(orCtrl+D)，将固定并永久保留文本。放大镜：左键放大，右键缩小。拖手工具：当图片很大超过显示器窗口时，可以使用拖手工具将感兴趣的区域已到显示窗口中央。按住空格键可以暂时用鼠标左键来拖动图像。颜色吸管：可以设置前景的画笔或文字的颜色。可以左键图片某处选择该处的颜色，也可以双击按钮显示颜色窗口来选择颜色。其他工具中有部分是和画图有关的工具，如喷壶等。3、如何使用之基础知识部分（安装过程略）图片编辑与分析（在编辑图片前建议拷贝一个副本后编辑）取消（Undo）：Edit→Undo，恢复到前一步，不过只能回退一步，这点和photoshop操作是一样的。恢复（Revert）：File→Revert，恢复到上次保存后的状态。裁剪（Crop）：Image→Crop.方框选择工具选好区域后进行裁剪。清除界外（ClearOutside）：Edit→ClearOutside.将选择区域以外图形清除。相类似Edit→Clear是清除选择区域内部。改变亮度对比度（BrightnessandContrast）：Image→Adjust→Brightness/Contrast，类似于photoshop里的操作。可以是图形的明暗对比更明显或更模糊。（Process→EnhanceContrast.这个选项是自动改变对比度，小心使用）清除噪点：Process→Noise→Despeckle或者Process→Filters→Median此外，Process→Noise选项里面还有添加噪点的选项。旋转：Image→Transform→Rotate转化成灰度图：Image→Type→8-bit（8位），或16-bit（16位）阈值（Thresholding）：假设要计算组织或细胞HE染色图片的细胞数量，可以根据细胞核的数目来确定。具体步骤可以把图片变成灰度图，然后设置阈值使得高于某个值的部分凸显出来，这样就容易计数个数。操作为：Image→Type→8-bit；Image→Adjust→Threshold；通过拖动标杆来设置具体值，最后选择apply。红色的区域最后变成黑色，其他区域变成白色，整个图片变成二元图（非黑即白）。还可自动设置阈值：Process→Binary→MakeBinary。测量和计数：设置刻度：在标尺或其他已知长度的两点画一条直线，进入Analyze→SetScale,在设置标尺（Setscale）窗口里会显示直线的像素长度，键入实际中的长度以及单位。这样就会在像素和实际长度间建立联系。选择global，表示其它图片也将应用该标尺。设置测量指标：Analyze→SetMeasurements.可以选择需要测量的指标。如面积，灰度值等。测量两点间的距离：在亮点间直线，状态栏会显示相对于水平线的角度和长度。进入Analyze→Measure(orCtrl+M),在结果栏中显示，并可复制到excel中。测量特定区域：使用区域选择工具画出特定区域（也可用魔棒选择），然后测量Analyze→Measure，测量内容根据测量指标决定。计数微粒：将图片转化成8-bit灰度图，然后根据上述设置阈值（threshold），然后进入Analyze→AnalyzeParticles,键入微粒大小的下限和上限，并且选择显示轮廓（Showoutlines）和显示结果(DisplayResults)。点击ok，被计数的微粒将显示轮廓和编号。每个微粒的结果在结果窗口中被显示。保存文件：存成Tiff的要比jpeg的画质损失要少(File→SaveAs→Tiff)4、使用实例导入连续照片合成视频step1.打开软件，导入连续照片(File-Import-ImageSequence)。step2.另存为视频文件格式，并设置帧率即可(File-Saveas-AVI)。多色荧光照片叠加step1.打开软件，再开启要分析的图片(File-Open)。Step2.打开照片叠加对话框(File-Image-Color-Mergechannels)。Step3.正确完成对话框填写，完成照片叠加(File-Image-Color-Mergechannels)。计算细胞数：step1.打开软件，再开启要分析的图片(File-Open)。Step2.设定分析影像的阈值(Image-Adjust-Threshold,或快捷键Ctr+Shift+T)step3.调整阈值再按set决定。step4.选择analyzeparticle(Analyze-Analyzeparticle)并且记得要选择summarize，才会有分析的结果。step5.分析结果，可以看到原图像的视窗会出现电脑判读的数据，summary会显示个数及分析影像的区域大小用ImageJ软件给图片加标尺：step1.打开软件，再开启要分析的图片(File-Open)。根据照片上的刻度，在照片上用直线工具画一直线Step2.进行标尺校准：校准所标记直线所代表的实际长度及单位(Analyze-SetScale)Step3.设置标尺：设置标尺、长度、字体、显示位置等(Analyze-ToolsScaleBar)在照片上没有刻度的情况下，确定标尺长度与像素的关系你必须至少知道以下信息：1.拍摄照片时的实际放大倍率M。2.照片的分辨率R(像素/英寸）。假设在R(像素/英寸）分辨率条件下照片上的标尺长度b(宏观的，毫米或厘米）代表实际大小a（微观的，微米或纳米），那么：M=b/a，另外，标尺长度b是有P个像素组成的，那么R=P/b,=P=aRM.根据以上的关系你可以给照片确定一个合适的标尺长度。注意：计算的过程中量纲要一致。