HepG2细胞胰岛素抵抗模型

HepG2细胞胰岛素抵抗模型文献一委陵菜黄酮衍生物抗糖尿病活性及其作用机制研究（博士）参照文献[28,29]方法建立胰岛素抵抗的模型。以l*106/ml密度接种于96孔板,每孔l00ul,37°C,5%C02饱和湿度培养箱内孵育过夜,以无血清的RPMI1640培养液同步化24h,模型组加入胰岛素终浓度为5*10-7mol/l的无血清RPMI1640培养液孵育24h,弃去培养液,用预冷的PH=4RPMI1640培养液洗4次,每次3min,同时设置正常对照组。以葡萄糖检测试剂盒应用葡萄糖氧化酶一过氧化物酶法(GOD—POD法)检测细胞上清液中葡萄糖含量,计算24h各组细胞的葡萄糖消耗量,确定胰岛素抵抗细胞模型的形成。将模型细胞和正常细胞于倒置显微镜下观察细胞形态学变化。将模型细胞置于不含胰岛素的培养基中24h后,用葡萄糖检测试剂盒测定培养基的葡萄糖含量,计算各组细胞的葡萄糖消耗量。观察HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型的持续时间。结果处理：以葡萄糖氧化酶法检测96孔板中每孔培养液葡萄糖的含量,与未接种细胞的空白孔糖含量均值相减,计算葡萄糖的消耗量。于505nni处以酶标仪检测0D值。待测液葡萄糖浓度(mmol/)=(待测液OD值/标准液0D值)*5.55mmol/l造模前后，形态的改变：倒置显微镜下观察,HepG2细胞为梭形或菱形的贴壁细胞,呈典型的肿瘤细胞形态学特征,HepG2/lR模型细胞与对照细胞相比,形态学特征未见明显改。文献二参考文献[75-76]的基础上加以改进，将细胞以3000个/孔接种于96孔培养板中。分为空白组和模型组。待细胞贴壁长至80%后，空白组加入正常培养液（胎牛血清浓度为5%），模型组加入新配置的含有胰岛素浓度分别为20、10、5、2.5、1、0.5μg/mL的培养液（胎牛血清浓度为5%），于37℃，5%CO2培养箱中孵育36h后，吸弃培养液，换上无血清无酚红的培养液，孵育12h后，用葡萄糖测定试剂盒[6]检测培养液上清液中的葡萄糖含量。计算空白组与不同胰岛素浓度组细胞的葡萄糖消耗量差值，选择葡萄糖消耗量差值最大，即达到胰岛素抵抗最高状态的胰岛素作用浓度为胰岛素最佳浓度。文献三:地黄寡糖HepG2胰岛素抵抗;过氧化物酶体增殖物激活受体Q:葡萄糖转运蛋白2按文献方法，稍作改进将处于对数生长期的细胞消化后,用含2%FBS的DMEM培养基调整细胞密度为106个一,,转入%孔板中待细胞单层贴壁后,加入新配制的含有胰岛素的培养液,并设无胰岛素的空白孔,于37e!5%CO:培养箱中孵育36ho弃去培养液,先用0.02mol#L一.PBs洗涤l次,再用pH6.0的培养基37oc孵育20min重复上述过程一次,最后用0.01mol.L.,PBS洗涤后,换上无血清的培养基孵育24h后,用葡萄糖临床试剂盒检测培养基的葡萄糖含量以不铺细胞的空白孔为空白对照,计算24h各组细胞的葡萄糖消耗量采用此方法通过优化胰岛素浓度和胰岛素作用时间建立适宜的高浓度胰岛素诱发的HepG2细胞胰岛素抵抗模型文献二甲双胍、罗格列酮对脂肪和肝脏色素上皮衍生因子表达分泌的影响及机制研究第一天：细胞接种到96孔板，肝细胞融合至80%左右（3T3-L1脂肪细胞诱导成熟后），无血清培养基培养8小时第二天：给予不同浓度（0、0.05、0.5、5、50nM）的胰岛素处理24h第三天：葡萄糖(2-NBDG)摄取检测A.去除上清，KRB洗2次，多功能酶标仪第一次荧光读数Fa值（Ex/Em488/520）B.加入2-NBDG（50uM）37°C培养箱放置15min，KRB洗2次，第二次荧光读数Fb值（Ex/Em488/520）C.加入100nM胰岛素，同时加入2-NBDG（50uM）37度培养箱放置15min，KRB洗2次，第三次荧光读数Fc值（Ex/Em488/520）D.MTT法测定每孔的细胞数：每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。E.每孔细胞的葡萄糖摄取能力:(Fc-Fb)/(Fb-Fa)/MTTF.选取最佳胰岛素浓度进行后续实验结果讨论：参考文献[8-10]，选择高胰岛素法建立IR的细胞模型：分别给予HepG2肝细胞和诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞不同浓度（0、0.05、0.5、5、50nM）的胰岛素作用24小时，并检测100nM的胰岛素刺激前后，葡萄糖（2-NBDG）摄取的变化。结果发现，当胰岛素浓度为50nM时，HepG2肝细胞和3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取均较正常对照明显减少（图1-13），提示IR细胞构建成功。通常模型细胞胰岛素结合率和葡萄糖摄取能力低于对照细胞50％，认为模型成功建立。