菌种扩大培养

第三节微生物菌种生长条件温度pH氧种龄接种量温度最低生长温度：微生物能进行繁殖的最低温度最适生长温度：微生物生长繁殖速度最快温度最高生长温度：微生物能进行繁殖的最高温度致死温度：致死微生物的最低温度pH大多数微生物生长适应的pH跨度为3-4个pH单位，最佳生长pH跨度在0.5-1pH最适范围:细菌和放线菌6.5-7.5；酵母和霉菌在4.5-5.5氧影响因素培养及成分和浓度菌龄影响发酵条件影响有毒代谢产物影响通风和搅拌培养罐深，搅拌转速大，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解度就大，培养基的黏度越小，氧的溶解度越大过度搅拌会导致培养液大量涌泡，增加染菌机会种龄与接种量：种龄(seedage)指种子罐培养种子从开始至结束的培养时间。在种子罐中，培养时间延长－－菌体量增加－－基质消耗及代谢产物积累－－菌体量不再增加－－老化过老：生产能力下降，菌体自溶。过嫩：前期生长缓慢，发酵周期延长，产物形成时间推迟，甚至造成异常发酵。适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，培养１２小时接种，酶活最高。接种量(seedvolume)指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比。Antibiotic：7%~7.5%Glu：1%接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物形成提前。原因：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基质的利用２、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。e.g.嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶接种1%，酶活最高；1.5%~4%影响不大；大于4%，酶产量明显下降。第四节菌种扩大培养种子扩大培养：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。菌种扩大培养的目的：发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会优良种子应具备的条件菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理性状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。种子制备过程实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等）或液体摇瓶培养生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养种子制备步骤斜面培养基中活化；扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；种子转种至发酵罐一、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基或斜面（静置培养）培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法(通过摇瓶培养提供比较好的溶氧）。实验室种子的制备-1e.g产黄青霉菌(P.chrysogonum)原始菌种斜面试管获得孢子250ml茄子瓶（大米或小米）25~28℃，4~14天成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保存）。对于不产孢子的赤霉素生产菌，也可用大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌，产卡那霉素的卡那链霉菌，可以用摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为种子。不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞悬液再接种。e.g.Glutamicacid-producer：（谷氨酸生产菌）原始菌种（出发菌种）固体试管斜面（32°C，18~24小时）三角瓶培养（摇床）(flaskculture)种子罐培养放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28˚C。培养时间为5~14天。碳氮源不要太丰富干燥和限制培养直接或间接诱导孢子形成母斜面孢子接种利于防止菌种变异；子斜面孢子接种利于节约菌种用量霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28˚C。培养时间一般为4~14天。细菌培养物的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37˚C。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。实验室阶段-2将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程摇瓶种子制备孢子发芽和菌丝繁殖慢菌种经摇瓶培养后再进入种子罐(子瓶比母瓶营养高，接近种子罐配方)二、生产车间种子制备：种子罐的作用：使有限数量的孢子(菌体)发芽、生长、并繁殖成大量的菌丝体(菌体)，满足发酵罐的需要（菌体生长和产物形成）。实验室种子进入种子罐有孢子进罐法和摇瓶菌种进罐法。种子罐级数的确定：种子罐级数是指制备种子逐级扩培的次数。依据：菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖的速度以及所用的发酵罐的容积。种子罐级数越少越好，原因：简化生产工艺和控制减少接种带来的染菌机会需考虑：尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生产而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率［产物／ml·h］。e.g.Glutamatefermentation一级种子扩培实验室种子种子罐发酵罐e.g.penicillinfermentation二级种子扩培实验室种子一级种子罐二级种子罐发酵罐e.g.Streptomycinfermentation三级种子扩培实验室种子一级种子罐二级种子罐三级种子罐发酵罐(Streptomycesgriseus)－－灰色链霉菌2接种龄与接种量接种龄种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。大量地接入培养成熟的菌种的优点：缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率节约发酵培养的动力消耗有利于减少染菌机会放射形土壤杆菌多糖（ARPS）发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体的体积的比例接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足种量过少延长发酵周期，形成异常形态，且易造成染菌以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据接种量的大小直接影响发酵周期种子质量的判断方法通常检测的培养液中参数pH是否在种子要求的范围之内糖、氨基氮、磷酸盐的含量菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观有无杂菌污染其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾气等3种子培养⑴工业微生物菌种类型A.静置培养，又为嫌气发酵，以厌氧菌居多B.通气培养，又为好气发酵，以需氧菌和兼性需氧菌居多⑵培养方法及特点A.液体培养法：液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养B.表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养C.固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养⑵培养方法及特点表面培养一种好氧静置培养法，不需深层的搅拌和通气，省动力。如醋酸、柠檬酸发酵等。固体培养浅盘和深层固体培养，统称取法培养。固体曲的酶活力高。液体深层培养易按照生产菌种对代谢营养要求及不同生理时期的要求条件，选择最佳培养条件。三.影响种子质量的因素1.原材料质量：如四环素、土霉素生产中配制孢子培养基的麸皮（wheatbran）、霉菌用的大（小）米、琼脂的牌号的不同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同，如微量元素Mg++、Ca++、Ba++能刺激孢子的形成。P含量的多少也影响种子的质量。氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，加入其他的营养物（麸皮水解液、豆饼水解液、玉米浆），也对种子质量多少有些影响。一般情况：培养基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。种子罐和发酵罐培养基成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各成分的数量根据目的各自确定。总之，各成分选择得当，才能发挥菌种的特征，提高产量。2.培养条件：温度、pH值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质量。制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量影响很大。如土霉素生产菌种龟裂霉菌的孢子，在北方干燥地区孢子斜面长的快，在含少量水分的试管斜面培养基中下部孢子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。一般相对湿度40~45%时孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好。培养时间和冷藏时间对种子和孢子形成都有影响。如土霉素菌种孢子斜面培养四天左右，即于4℃冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体自溶，而培养五天以后冷藏，20天未发现自溶。链霉素生产菌，斜面孢子在6℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低8%。种子培养注意问题泡沫控制影响：氧的吸收；二氧化碳排放；缩小发酵容积；引起染菌等原因：通气、搅拌、成分变化、微生物代谢活动措施：机械法（振动或压力）、化学法（消泡剂）、改善培养基成分等染菌控制原因：设备管道等泄露、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严或菌种不纯等控制：消毒到位，无菌操作；纯菌种；工艺条件严格控制等四.种子质量的控制措施必须保证生产菌种的稳定性提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌侵入1.菌种稳定性的检查：少量菌种--无菌生理盐水--递增稀释--平板划线培养。挑出形态整齐，孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力。2.无菌检查：显微镜观察、种子液进行无菌检验、生化分析。种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、异常现象及镜检是否有杂菌。发酵终点判断（P51）经济因素最低成本获得最大生产能力的时间产品质量因素发酵周期对提取工艺及产品质量的影响特殊因素染菌、代谢异常等合理的放罐时间有实验确定