梅毒血清学检测策略及影响因素

梅毒血清学检测策略及影响因素重庆市涪陵中心医院涂伟2019/11/28梅毒概述梅毒是由苍白螺旋体引起的一种慢性、系统性性传播疾病。人体受感染后，几乎可侵犯全身各组织与器官，临床表现多种多样，且时显时隐，病程较长。≪中华人民共和国传染病防治法≫规定要管理的主要性病之一。早期主要侵犯皮肤及粘膜，晚期除侵犯皮肤、粘膜外，还可侵犯心脏血管系统及中枢神经系统；另一方面，梅毒又可多年无症状呈潜伏状态。梅毒主要通过性接触传染，亦可通过血液和母婴垂直传播。梅毒螺旋体梅毒是一种性传播疾病，病原体为梅毒螺旋体，属于密螺旋体属，苍白密螺旋体苍白亚种(Treponemapallidumsubspeciespallidum)极细亚种雅司病地方亚种地方性梅毒苍白亚种梅毒苍白螺旋体品他螺旋体品他病密螺旋体属我国基本消灭（1950-1964年）现在呈逐年增加的趋势我国政府针对梅毒控制的相关政策•中国预防与梅毒规划（2010-2020年）•性病管理办法（2013年）•预防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传播工作实施方案•………梅毒分期时间•一期梅毒•二期梅毒•三期梅毒•隐形梅毒•胎传梅毒梅毒是一个可以临床治愈的传染病病例诊断依据（ws273-2007）病史症状实验室检查实验室检查结果对梅毒诊断及判愈有决定性意义梅毒实验室检测方法病原学检测梅毒血清学检测组织病理学检测白细胞检测蛋白检测病原学检测•暗视野显微镜检查•镀银染色法•核酸检测（血液标本？？）梅毒血清学检测方法（1）梅毒非特异性抗体检测（非梅毒螺旋体抗原血清学试验）（2）梅毒特异性抗体检测（梅毒螺旋体抗原血清学试验）梅毒非特异性抗体检测原理梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主可对螺旋体表面的脂质做出免疫应答，产生抗类脂抗原的抗体（即非特异性抗体）。未经治疗的患者，其血清内的非特异性抗体可长期存在。经过正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度或直至转为阴性。•反应原理–抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见•抗原基本成分–心磷脂、卵磷脂和胆固醇•方法包括：–快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)–不加热血清反应素(USR)–甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）–性病研究实验室试验(VDRL)等。中华人民共和国卫生行业标准WS/T491-2016梅毒非特异性抗体检测操作指南常见的测定影响因素•水平旋转仪（100+2r/min）•反应时间•专用抗原滴针的加样量要求，抗原量每滴为17ul左右•反应板的要求：无污染、试剂打开后不可冷藏保存局限性假阴性反应•感染梅毒螺旋体后，机体免疫应答需要一定过程，抗类脂质的抗体浓度尚处于实验方法的检测限之下，称为窗口期，可发生假阴性反应。•少数早期梅毒和神经梅毒以及部分晚期梅毒，可发生定性试验假阴性反应。前带现象•部分早期梅毒（1%-2%的二期梅毒，0.5%-1%的一期梅毒）的样品可出现前带现象•样品类型血浆中抗体浓度显著高于血清，同一患者的血清和血浆检测结果不可直接比较。虽然VDRL、RPR、TRUST的检测原理基本相同，但因采用的抗原原料和生产工艺的不同，各种方法和试剂之间可能存在一定范围的敏感性和特异性的系统性差异。任何2中方法的定性和半定量结果，相互之间不可直接比较。当采用梅毒非特异性抗体作梅毒筛查用途时，应选择敏感性高的方法或试剂。假阳性问题假阳性：非梅毒患者的血清反应呈阳性①技术性假阳性由于标本的保存不当（如细胞污染或溶血）、试剂质量差或过期、或实验室操作错误所造成。②生物学假阳性是由于患者有其他疾病或生理状态发生变化，使梅毒血清试验出现阳性。急性生物学假阳性反应的疾病风疹水痘传染性单核细胞增多症传染性肝炎上呼吸道感染肺炎球菌性肺炎病毒性肺炎牛痘疹慢性生物学假阳性反应的疾病系统性红斑狼疮自身免疫性溶血性贫血盘状红斑狼疮结节性多动脉炎类风湿性关节炎桥本氏甲状腺炎风湿性心脏病干燥综合征毒品瘾者慢性肾炎肝硬化老年麻风(是唯一产生慢性生物学假阳性的感染性疾病)梅毒特异性抗体检测•抗原为梅毒螺旋体特异蛋白（包括螺旋体重组特异性抗原），检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。•感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则该患者基本终生阳性。梅毒螺旋体的抗原结果外膜脂蛋白抗原47、44.5、43、36、34、17、15KDa成分，其中47含量高，免疫原性强，为主要抗原，但与其他两种致病性螺旋体有交叉反应）轴丝抗原轴丝为运动器官，37、35.5、33KDa4D抗原为梅毒螺旋体特异性表面抗原，均匀分布在梅毒螺旋体表面。梅毒特异性抗体检测技术•梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）•梅毒螺旋体血球颗粒凝集试验（TPHA）•酶联免疫试验（ELISA）•化学发光免疫分析法（CLIA）•免疫层析法—梅毒快速检测（RT）•荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）•蛋白印迹试验（WB）TPPA/TPHA原理•TPPA试验原理与TPHA试验基本相同–TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒–TPHA试验中梅毒螺旋体致敏羊红细胞•特点–梅毒螺旋体(Nichols株)全抗原SerodiaTPPA的操作步骤6、结果判读1、加入样品稀释液100µl25µl25µl25µl孔号143212、加入测试样品25µl孔号14321致敏颗粒4、加入明胶颗粒最终稀释倍数孔号143211:401:8025µl25µl未致敏颗粒5、混匀，加盖，孵育2个小时3、样品的倍比稀释孔号14321最终稀释倍数1:201:4025µl25µl25µl25µl弃去判断标准粒子光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠粒子光滑覆盖大部分孔底粒子光滑覆盖孔底，周围有一细胞环粒子光滑覆盖孔底，周围有一明显细胞环粒子沉积孔底，中央形成一小点粒子紧密沉积孔底中央ELISA/CLIA•原理用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶标仪判定试验阳性反应。•特点本法可用于大规模血清检测。化学发光法的临床应用意义基本同ELISA。化学发光的敏感性？？免疫层析梅毒IgM抗体IgM抗体的产生是感染后的早期体液免疫应答反应。IgM抗体不能通过胎盘屏障和血脑屏障，而母体的IgG抗体可以通过胎盘屏障传给胎儿，血液中的IgG抗体也可以通过血脑屏障进入脑脊液中，因此若在新生儿血中检测到IgG抗体不能作为先天梅毒的诊断依据，而IgM抗体可作为先天梅毒的诊断依据。同时，梅毒IgM抗体检测还可以用于神经梅毒、早期梅毒的诊断依据。梅毒各类抗体出现时间先天梅毒的诊断先天梅毒的诊断标准必须具备以下条件之一：1.暗视野显微镜镜检梅毒螺旋体阳性；2.梅毒螺旋体IgM抗体阳性；3.RPR/TRUST检测阳性，滴度比母亲分娩前最近一次滴度高4倍以及上；4.RPR/TRUST检测随访中，任何一次滴度不下降或反而上升；5.满18月龄后，TPPA检测仍为阳性。梅毒的血清固定梅毒血清学实验室检测策略梅毒血清学检测目的与策略的关系传统策略逆向策略双检策略试验结果参考结果解释梅毒特异性抗体检测梅毒非特异性抗体检测阳性阳性可能为现症梅毒阴性阳性非梅毒螺旋体血清学试验假阳性阳性阴性临床治愈的早期梅毒（既往感染者）或极早期梅毒阴性阴性排除梅毒感染或极早期梅毒总结非特异性和特异性两类抗体检测均可作为梅毒初筛试验。任何一类抗体初筛阳性均需要采用另一类方法复检验证才能作为梅毒诊断的依据。两类抗体检测均存在窗口期，但窗口期时间不一样。非特异性抗体定性试验用于梅毒初筛和诊断，定量试验用于疗效观察。目前推荐采用逆向检测策略，可采用任何一种特异性抗体检测技术，但要了解其敏感性和特异性的差异。蛋白印迹试验(WB)-IgG和IgM抗体检测在先天和后天梅毒中的应用意义。