甘油脱氢酶

以生物柴油甘油为底物生产DHA的菌株的产量优化及甘油脱氢酶酶学性质研究姓名：郑小娟指导老师：刘宇鹏1实验背景及意义2实验内容及目标3实验创新点与难点4实验进程安排5实验前期进展一、研究背景及意义1.1DHA概述二羟基丙酮或1,3-二羟基丙酮,英文名为1,3-dihydroxyacetone，简写为DHA，是最简单的三碳酮糖，外观是白色或类白色粉末状结晶,具有甜、凉的味道，易吸湿并分解。一般状态下是二聚体(1,4-Dioxane)的结晶。DHA分子中含有3个官能团(2个羟基、1个羰基)，化学性质活泼。1.2DHA用途化妆品领域人工美黑、保湿、防晒和防紫外线辐射的作用。医药领域治疗白癫风、预防保护混合型卟啉病、DHA对氰化物中毒具有解毒效果、抑制寄生虫、抗鸡瘟病毒化工领域化学性质活泼，能参与聚合、缩合等化学反应，做为中间体在合成医药和农药方面具有重要作用。食品领域DHA被用作保健和功能性食品添加剂、风味添加剂、食品果蔬的保鲜剂等。其他用途：瘦肉型饲料添加剂、皮革制品的保护剂。DHA用途BECDA用于二羟基丙酮衍生物的合成用于保湿防晒化妆品医用：用于治疗白斑、白癜风、抗鸡瘟病毒促进猪瘦肉的增长抗肥胖作用1.3DHA生产方法化学合法法固定化法发酵法化学法生产效率低，成本高，环境污染严重，底物利用率低固定化法包含固定化细胞和固定化酶，其优点是固定化细胞能重复使用，酶活力高，转化效率高，后期分离提取简单。但前期固定化繁琐。发酵法具有可利用廉价原料直接生产DHA的优点，但是发酵生产周期长，工艺管理要求严格。1.4用来生产二羟基丙酮的微生物资源菌株来源较佳工艺下产量（g/L）甘油转化率ZX12郑裕国（J）200116.016%BacuiluslicheniforminB-05571郑裕国（P）200668.085%GluconobacteroxydansGUR186张小飞（T）2006132.094%Acinetobactersp.6-8徐美娟（J）20086.412.8%PichiamembranifaciensZJB-0009柳志强（J）200813.9534.8%GluconobacteroxydansGM51马立娟（T）200982.8192%GluconobacteroxydansCGMCC1.63760.3960.39%GluconobactersphaericusCICC1035727.9427.94%•本实验室筛选菌种，GluconobacterfrateuriiHD924•保存于北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心,保藏号CGMCC5397•已授权中国发明专利，专利号：ZL201110388519.81.5研究意义随着石油价格高涨且波动频繁，从而引发石油危机.燃料乙醇和生物柴油的出现在一定程度上缓解部分危机。在生物柴油生产的过程中，会产生大量含粗甘油的副产物，每生产10kg的生物柴油，约得到1kg的含甘油的副产物。国内利用DHA作为化工原料和医药中间体，后续开发的产品种类很多，而且这些产品的市场容量也很大。目前国内对DHA的需求量已超过1000t/a，预计随着生产成本的降低，其需求量将进一步扩大。目前甘油的市场价格为4000～5000元/吨（医药食品级价格在8000~10000元/吨），二羟基丙酮市场价格为10~13万左右。而微生物法生产DHA转化率高达90%以上，因而采用生物法生产DHA利润巨大，具有极高的经济效益。1.6国内外研究现状国外在上世纪七十年代已经形成成熟的生物法生产DHA产业。当前,DHA的微生物发酵生产主要分布在美国、英国、德国和日本,其中约50%的DHA用于生产化妆品。日本大赛璐化学工业公司以甘油为原料采用发酵技术进行制备DHA,年产量达到100t。50%用于化妆品领域。在国内，由浙江工业大学郑裕国教授开发的微生物发酵产DHA经过10年的发展现已在浙江海正药业股份有限公司完成10t发酵罐规模的生产性试验。本实验室与浙江长兴制药厂合作生产DHA项目已经完成第一阶段生产，目前正在进行年产1000吨DHA扩产改造工作。孙玲艳等2.10gL-1h-1Hekmat等2.80gL-1h-1Ma等2.29gL-1h-1张小飞等3.00gL-1h-1产率分析冯屏等8.97gL-1h-1BACK二、实验内容及目标氧的传质速率Kla的提高对DHA产量的影响DHA产量的提高甘油脱氢酶在费托氏葡萄糖酸杆菌细胞内过量表达对二轻丙酮产量的影响1氧的传质速率Kla的提高对DHA产量的影响发酵液中的溶氧浓度对微生物的生长和产物形成有着重要的影响。研究溶氧对发酵的影响及控制对提高生产效率，改善产品质量等都有重要意义。氧的传质速率KLa是是发酵过程中溶解氧水平的重要参考水平。控制KLa的途径可分为操作变量、反应液的理化性质和反应器的结构3个部分。操作变量包括温度、压力，通风量和转速(搅拌功率)等，发酵液的理化性质包括发酵液的黏度、表面张力、氧的溶解度、发酵液的组成成分、发酵液的流动状态、发酵类型镣反应器的结构指反应器的类型、反应器各部分尺寸的比例、空气分布器的形式等。当然有些因素是相互关联的。费托氏葡萄糖酸杆菌为专性好氧微生物,通过有氧呼吸获取能量,在催化甘油生成二羟丙酮的反应时以氧气为电子受体。因此,发酵过程中,氧气的供应直接影响着菌体的最终生物量及代谢产物的最终浓度。本实验通过使用挡板摇瓶和提高发酵罐的体积、罐压、搅拌速度来提高发酵过程中的Kla，提高甘油的转化效率，提高DHA的产量。左：挡板摇瓶右：非挡板摇瓶2甘油脱氢酶在费托氏葡萄糖酸杆菌细胞内过量表达对二羟丙酮产量的影响甘油脱氢酶（GDH）是生物催化甘油生产二羟丙酮的关键酶，该酶能够使甘油分子结构上的仲位羟基进行脱氢反应生成DHA。在弗托氏葡萄糖酸杆菌中，甘油脱氢酶是催化甘油生成二轻基丙酮的关键酶，该酶为膜结合酶，包括大小两亚基，分子量分别为79.4kDa和13.7kDa。甘油脱氢酶以PQQ为辅基，催化反应时以氧气为最终电子受体而无需NADH参与，是一种需氧反应最近的研究发现，甘油脱氢酶具有广泛的底物谱，同时也是催化阿拉伯醇、山梨醇和葡萄糖酸生成相应酮糖的关键酶。近年来，随着分子生物学的发展使得构建出DHA产生途径中的甘油脱氢酶过量表达的基因工程菌成为一种可能。在甘油脱氢酶的克隆表达研究方面，国内外已经已经有了一些研究。Gatgens等利用强启动子tufB和gdh使G.oxydans膜系脱氢酶sldAB基因过量表达，使微生物法生产DHA的产量可以达到350mmol/L，DHA产量比普通菌提高了75％。除将G.oxydans中甘油脱氢酶过量表达以外，也有学者考虑利用基因重组技术在宿主菌中表达异源甘油脱氢酶基因来提高DHA的产率。华东理工大学的魏东芝等人研究以沙门氏菌、克雷伯氏菌、醋酸杆菌、志贺氏菌、大肠杆菌或氧化葡萄糖杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增获得编码甘油脱氢酶基因gdh和编码NADH脱氢酶基因ndh，利用PET系列表达载体分别构建基因工程质粒pET-gdh和pET-ndh，并将其分别或共同转入大肠杆菌中，利用该重组菌代谢甘油生产DHA，提高了DHA的产率。本课题拟从基因工程育种的角度出发，以本实验室筛选出来的专利菌种弗托氏葡糖杆菌染色体DNA为模板，扩增编码甘油脱水酶基因，构建含甘油脱氢酶基因的重组大肠杆菌，将其插入到大肠杆菌表达载体进行诱导表达，并研究其酶学性质及全细胞催化工艺条件，为下一步利用微生物酶法转化甘油为二羟丙酮打下良好的基础。主要包括以下内容：231弗托氏葡糖杆菌甘油脱氢酶基因的克隆及表达。甘油脱氢酶的分离纯化及其酶学性质研究。利用基因工程菌进行全细胞催化生产DHA工艺条件研究。技术路线：BACK三.实验创新点及难点onetwothreefour生物法生产DHA的主要原料是废甘油，对于化学工业可持续发展和推进循环经济意义重大。本实验为国内外首次对弗托氏葡糖杆菌的甘油脱氢酶基因进行克隆和表达，具有创新意义。对甘油脱氢酶的酶学性质研究，为利用基因工程菌生物催化生产二羟丙酮的工业化应用打下良好的基础。实验创新之处本实验首次研究了Kla对发酵生产DHA的影响。实验难点BACK目前，研究Kla对发酵生产DHA的影响还未见报道，而且Kla系数的测定也存在一定难度。利用基因工程菌过量表达甘油脱氢酶尚未有成功报道，本项目拟利用本课题组前期筛选出来的高活性甘油脱氢酶菌株弗托氏葡糖杆菌构建基因工程菌，将填补该项技术空白，具有非常重要的理论意义。2013.9～2014.1弗托氏葡糖杆菌甘油脱氢酶基因的克隆2014.2～2014.5基因工程菌的构建及酶的诱导表达，挡板摇瓶产量测定。2014.5～2014.9甘油脱氢酶的分离纯化及其酶学性质研究2014.10～2014.12基因工程菌甘油脱氢酶的全细胞转化工艺条件研究，7.5L、30L发酵罐产量测定。2015.1～撰写论文四.实验进度BACK五.实验已完成工作5.1Kla对发酵产量的影响非挡板摇瓶与挡板摇瓶底物甘油浓度分别为50g/l、75g/l、100g/l、125g/l、150g/l，每瓶的装液量为50ml。在发酵过程中，每2个小时从每个摇瓶中取1ml的样品，测定样品的OD，并测定样品中甘油残余，直至摇瓶中的甘油残余低于1g/l停止发酵。非挡板摇瓶里不同甘油浓度对费托氏葡糖杆菌的生长和DHA产量的影响时间（h）总甘油量（g/l）比生长速率（μmax/h)转化率（Yx/s，g/g）DHA产量（g/l）DHA产率（g/l/h）26500.022±0.0010.68±0.0233.951.3134750.017±0.0020.71±0.0153.251.56421000.011±0.0010.74±0.0173.851.76631250.006±0.0010.65±0.0181.251.28751500.004±0.0010.57±0.0185.201.18挡板摇瓶里不同甘油浓度对费托氏葡糖杆菌的生长和DHA产量的影响时间（h）总甘油量（g/l）比生长速率（μmax/h)转化率（Yx/s，g/g）DHA产量（g/l）DHA产率（g/l/h）10500.063±0.0010.76±0.0138.053.8112750.052±0.0010.79±0.0159.254.93161000.041±0.0020.81±0.0182.014.99251250.027±0.0010.85±0.02106.254.25381500.013±0.0010.87±0.01131.163.455.2甘油脱氢酶基因的克隆根据GeneBank上甘油脱氢酶的基因序列设计两组引物大亚基和小亚基分别设计引物Large-SacI-sAAAAGAGCTCCGCCGGCCTTACCTTCTCGCAACLarge-HindIII-aAACCAAGCTTTTACTGCTTGATGGCATCCGGCAGTSmall-EcorI-sGCCAGAATTCCCAAATCTTCAAGGTAATAGGSmall-HindIII-aAACCAAGCTTTTAGACGGCTCCTCTGAGAGTA包含启动子的合并引物135-Hindlll-sCATAAGCTTGGCGTTTACGATGGTGC135-Kpnl-aCTAGGTACCGTGAACGAAAACAGCCTG根据引物Large的Tm值设计退火温度进行梯度PCR以确定最终退火温度为62℃。温度依次为：61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃根据引物Small的Tm值设计退火温度进行梯度PCR以确定最终退火温度为56℃。温度依次为：56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃根据引物135的Tm值设计退火温度进行梯度PCR以确定最终退火温度为53℃。由于前两个杂带太多，特异性差，故选用53℃。温度依次为：49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃谢谢各位老师请提出宝贵意见！