植物组织细胞培养生产紫杉醇的研究进展

植物组织细胞培养生产紫杉醇的研究进展背景介绍•紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物,也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。药理•细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。•通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。获取紫杉醇的途径•化学合成•红豆杉中提取•真菌发酵•植物组织培养化学合成1.全合成：路线复杂，反应条件难以控制，产率低，用到剧毒原料，仅限于实验室水平2.半合成：国外专利技术壁垒，国内生产附加值低红豆杉中直接提取•资源匮乏红豆杉生长缓慢，树皮剥取后不能再生，树木将死去•紫杉醇在植物体内含量极低，最多0.069%•需多步柱分离技术，生产成本高真菌发酵•真菌发酵生产紫杉醇因真菌的紫杉醇含量仅有植物细胞的十万分之一,离生产的距离太远。•从长远来看,植物组织培养才是解决紫杉醇供需矛盾的最佳途径。组织培养•组织培养是在无菌和人为控制外因（营养成分、光、温、湿）的条件下，培养和研究植物组织、器官，甚至进而从中分化、发育出整体植株的技术。植物组织培养•愈伤组织培养•继代培养•悬浮细胞培养•紫衫细胞大量培养愈伤组织培养•选择合适的外植体：以幼茎为佳•除去病原菌和杂菌：处理外植体•配置合适的培养基。•诱导及培养：将上述小块组织接种于MS培养基中，于25℃的二氧化碳培养箱中培养40天。PH5.8，诱导和分化，即可形成小的愈伤组织块继代培养•愈伤组织长出后经过4~6周的迅速细胞分裂，原有培养基的水分和营养成分多以耗失有害代谢产物已在培养基中积累，必须移植。即是继代•愈伤组织也易分泌橙红色色素或发生褐化，使生长速度减慢，甚至死亡（这是愈伤组织分泌的酚类物质被氧化成醌类物质造成的）。*缓解褐化•在培养基中加入还原剂或吸收酚类的物质,可以减少致死现象,保持愈伤组织的生长活性。•如：半胱氨酸、维生素C、活性炭•PS：由于吸附剂对营养物质和激素的吸收,较高浓度的吸附剂会部分地抑制愈伤组织的生长继代悬浮悬浮培养步骤：悬浮细胞培养•只有当愈伤组织经过长时期固体培养,表现出相当的生理稳定性后,才能进行悬浮培养。一般采用B5培养基，碳源多为蔗糖。温度、接种量、光照强度，pH值等的改变均能影响细胞的生长率和产物合成•半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液•连续培养：连续收获细胞，同时不断补充培养液加入培养基排出培养基及其培养物紫衫细胞大量培养•前期利用碳水化合物的选择加快细胞生长,使细胞量迅速增加。达到一定细胞量后,改用利于紫杉醇合成的培养液。通过调整合成培养液的组成,延长紫杉醇合成时间（静止期）。•为了提高生产率，需要提高活性细胞浓度，大规模地培养红豆杉细胞。现在已经发展了不少大规模培养系统，同时使用固定化的细胞，原位提取等现代发酵技术方法能够在一定程度上提高活性细胞的浓度。提高紫杉醇产量的方法前体饲喂添加抑制剂添加诱导因子筛选细胞株系前体饲喂•一方面可通过增加底物量来加快反应速度和提高产率•另一方面能够反馈抑制分支路径而促进反应顺利进行,有效提高紫杉醇产量。•常用：苯甲酸，苯甲酰甘氨酸添加抑制剂•添加抑制剂能够反馈抑制分支路径而使反应向有利于紫杉醇合成的方向进行。•发现合成代谢抑制剂氯化胆碱CCC可以使紫杉醇含量提高，但浓度过高却抑制合成。添加诱导子•紫杉醇是一种植物防卫素，可以被诱导•茉莉酸甲酯----参与植物防御信号的转导与放大•花生四烯酸----浓度为5µg/g时即可将紫杉醇含量提高9.3倍,与茉莉酸甲酯表现出明显的诱导协同作用。筛选出高产的细胞株系••诱导••变异•细胞克隆技术筛选•目前，主要运用现代生物基因工程的方法来获得高产细胞系紫杉醇含量高的外植体愈伤组织高产细胞植株问题与前景①红豆杉属植物组织细胞培养中的褐化现像，尚无良好的解决办法【8】②紫杉醇本身是一种细胞生长的毒性物质,其量的积累愈多,对细胞增殖的抑制越强.,即使添加真菌诱导子及生物合成前体,组织细胞培养生产紫杉醇也难以达到产业化应用水平【10】,③细胞培养物生长速度慢,有效物质含量低、成本高、大规模生产技术尚未过关【9】④添加诱导因子，在一段时间内可以增加紫杉醇产量，但随着细胞的遗传，会逐渐产生抗性，是产量降低，这也是无法工业化生产的一大原因。•⑤紫杉醇作为一种抗有丝分裂机制，在有丝分裂过程中，干扰了细胞的正常分裂，使红豆杉细胞染色体数目极易发生变化,红豆杉中紫杉醇的含量极不稳定，因此稳定的保存并筛选高产的紫杉醇细胞系显得尤为重要。•⑥现今又有一种新的培养高产细胞系的方法,即利用秋水仙素诱导建立四倍体红豆杉细胞系,实验证明,产量是普通二倍体的3.85倍.[13]参考文献•[1]邓立新.抗癌新药紫杉醇简介.化学教学,2006年，第1期•[2]KohlerDR，GoldspielBR.Paclitax（eltaxol）[J].Pharmacotherapy.1994，1（41）：3-34•[3]王蒂.植物组织培养.中国农业出版社，2004年6月第一版•[4]常明进，李春强，彭明.天然药物紫杉醇的研究与开发.安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2006,34(2):257-258•[5]邢建民,查丽杭,李佐虎,刘大陆.植物细胞培养生产紫杉醇的研究进展.植物学通报,1997,14(3):22～29•[6]Fett-NetoA.G.etal.1994aBiotechnol.Bioeng.44P205～210•[7]胡凯,何颖,祝顺琴,谈锋,唐克轩.红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇的研究进展.《天然产物研究与开发》.Vo1.15,No.5•[8]夏铭,吴绛云,张丽梅.红豆杉组织培养中褐变问题的研究.生物技术,1996;16(3):18-20•[9]张宗勤,杨建英,吴耀武.南方红豆杉组织培养及紫杉醇的产生.西北植物学报1998,18(4):488—492•[10]JaziriM,A.zhiri,Y.WGuoetal.Taxussp.cell,tissueandorganculturesasalternativesourcesfortaxoidsproduction:aliteraturesurvey.PlantCellTuiss.Org.Cult.,1996;46:59-75•[11]周忠强,梅兴国.红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究进展.中南民族大学学报(自然科学版)JournalofSouth-CentralUniversityforNationalities(Nat.Sci.Edition).第23卷第1期2004年3月•[12]WickerenesinheE.R.M.andR.N.Artac.1994.J.Plantphysil.144:183~193•[13]李丽琴,余龙江,高产红豆杉细胞系的建立与评价