酵母单杂交-实验步骤总结

1pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAir报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。（1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。（2）用TEbuffer溶解寡核苷酸至终浓度100mol/L。（3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50mol/L）。（4）95C保温30s，去除二级结构。（5）72C保温2min，37C保温2min，25C保温2min。注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。（6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20C冰箱备用。（7）酶切1LpAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5mol/L。（9）在连接反应管中加入如下成分：pAbAi载体（50ng/L）1.0Lannealedoligonucleotide（0.5mol/L）1.0L10×T4DNAligasebuffer1.5LBSA（10mg/mL）0.5LNuclease-freeH2O10.5LT4DNAligase（400U/L）0.5L总体积15L注：如果有必要，可用1Lnuclease-freeH2O代替寡核苷酸作为阴性对照。（10）将反应体系室温放置连接3h，转化Ecoli，采用常规方法检测阳性克隆。注：可用酶切或测序进行检测。2质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株（图）图3Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图（1）用BstBI或者BbsI酶切2LpBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi质粒，使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。（2）按MatchmakerYeastTransformationSystem2的步骤用1l酶切后的质粒转化Y1HGold酵母。（3）稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。3d后挑取5个单克隆，用MatchmakerInsertCheckPCRMix1进行PCR检测阳性克隆，用Y1HGold的单克隆做阴性对照。（4）在PCR管中加25lPCR-gradeH2O。（5）用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头伸进PCR-gradeH2O中搅拌，使酵母细胞散开。注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反应的进行。如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。（6）向每个管中加入25lMatchmakerInsertCheckPCRMix，混匀，离心。每个PCR管中现已含有如下反应物：MatchmakerInsertCheckPCRMix25lH2O/yeast25l总体积50l（7）按下述程序进行PCR反应；95C1min98C10s55C30s30cycles68C2min（8）取5lPCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。注：引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增片段长约1.4kb。图4PCR检测pBait-AbAi的插入情况正确的PCR检测结果应是：阳性对照：1.4kb阴性对照：无条带诱饵菌株：1.35kb+insertsize（9）分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura平板上划线培养。30C孵育3d后，将平板置于4C保存，即为新构建的Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi]对照菌株。（10）经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用1mL预冷培养基（100ml灭菌的YPDA与50ml灭菌的75%甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70C保存。3检测诱饵菌株AbAr基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达水平也不相同。例如：p53-AbAi对照的最低aureobasidinA抑制浓度为100ng/ml。注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbAr基因的表达情况十分重要。所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA浓度。（1）分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9%NaCl重悬细胞，调节A600到0.002（大约2000个细胞/100l）。（2）在下述培养基上分别涂布100l重悬后的菌液，30C培养2-3d。SD/-UraSD/-UrawithAbA（100ng/mL）SD/-UrawithAbA（150ng/mL）SD/-UrawithAbA（200ng/mL）预期结果如下所示：表1AbAr基因预期本底表达结果[AbA]/（ng/mL）Y1HGold[p53-AbAi]克隆数Y1HGold[pBait-AbAi]克隆数0约2000约20001000Baitdependent1500Baitdependent2000Baitdependent（3）在进行文库筛选时，使用AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑制浓度稍高的AbA浓度（高约50-100ng/mL），以彻底抑制诱饵菌株的生长。注：如果200ng/mLAbA不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA浓度至500-1000ng/mL。然而，在不存在捕获物的情况下，如果1000ng/mL的AbA浓度仍无法抑制AbAr基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的内源调控因子，因而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。4文库cDNA的合成提取试材总RNA，进行反转录合成cDNA。合成的cDNA末端具有与pGADT7-Rec相同的酶切位点。（1）cDNA第一链的合成①准备高质量的polyA和/或总RNA，用humanplacentapolyA+RNA作为阳性对照。注：RNA的质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的RNA。②在微量离心管中加入如下反应物：RNA模板（0.025-1.0gpolyA和/或0.10-2.0g总RNA）1-2lCDSIII（oligo-dT）orCDSIII/6（random）引物1.0lDeionizedH2O（使总体积达到4.0l）1-2l总体积4.0l在另外一支管中加入对照cDNA反应物，即RNA使用1l（1g）controlpolyA+RNA。③72C孵育2min。④冰上放置2min，轻轻混匀，立即加入步骤⑤中的试剂。⑤每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。5×first-strandbuffer2.0lDTT（100mmol/L）1.0ldNTPmixture（10mmol/L）1.0lSMARTM-MLVRT1.0l总体积5.0l注：步骤⑤中的试剂可在步骤②之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2min。⑥如果用的是CDSIII/6随机引物，25-30C保温10min。如果用的是CDSIII引物，省略此步，进行步骤⑦。⑦42C保温10min。⑧加入1lSMARTIIIoligo，充分混合，42C保温1h。⑨75C保温10min终止第一链的合成。⑩降至室温，加入1lRNaseH（2U）。1137C保温20min。12cDNA第一链合成产物应于-20C保存，可用3个月。（2）longdistancePCR（LD-PCR）合成cDNA第二链根据合成cDNA第一链时使用的RNA量，下表给出了进行LD-PCR时最佳的热循环数。使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。表2RNA量与最佳热循环数总RNA/gPolyA+RNA/g循环数1.0-2.00.5-1.015-200.5-1.00.25-0.520-220.25-0.50.125-0.2522-240.05-0.250.025-0.12524-26⑴LD-PCR反应混合物中加入如下物质（每个样品做2个100l体系，对照做1个100l体系）：First-strandcDNA（fromprotocolA）2lDeionizedH2O70l10×advantage2PCRbuffer10l50×dNTPmix2l5’RACE引物2l3’RACE引物2lMeltingsolution10l50×advantage2polymerasemix2l总体积100l⑵按照以下程序进行PCR反应：1个循环95C30sX个循环95C10s68C6min1个循环68C5min⑶取7lPCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用1kbDNAladder。（2）使用CHROMASPIN+TE-400柱纯化dscDNA⑴为每一个要纯化的cDNA样品准备一个CHROMASPIN+TE-400柱。⑵将纯化柱翻转几次，充分悬浮gelmatrix。⑶移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2ml收集管中。⑷将柱放入离心机，700g离心5min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。⑸将柱放入新的收集管中，把cDNA加到gelmatrix的中央，切勿使样品沿柱的内壁流下。注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段cDNA。⑹700g离心5min，纯化的cDNA收集到管中。⑺将两个纯化的cDNA样品合并到一管，测量体积。⑻加入1/10体积3mol/L醋酸钠（pH5.3），混匀。⑼加入2.5倍体积无水乙醇。⑽-20C冰冻1h。⑾室温，14000r/min离心20min。⑿小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。⒀14000r/min瞬时离心，去除残留上清液。⒁沉淀于空气中干燥10min。注：一般干燥至无乙醇味，不可过度干燥，否则很难溶解。⒂用20l灭菌去离子水溶解沉淀，此cDNA可用来进行同源重组构建文库。纯化后的cDNA用1%的琼脂糖电泳检测。5构建并筛选酵母单杂交文库（cDNA融合表达文库的构建及筛选）（1）构建并在SD/-Leu/AbA培养基上检测Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。注：AbA的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。（2）按SMARTtechnology步骤合成dscDNA，其浓度为2-5g/20L。（3）用YeastTransformationSystem2的方法转化酵母，在转化体系中加入如下物质：①cDNA文库转化Y1HGold[Bait/AbAi]菌株20lSMART-amplifieddscDNA（2-5g）6lpGADT7-Rec，（SmaI-linearized）（3g）②Y1HGold[53/AbAi]的转化5lp53fragment（125g）2lpGADT7-Rec，（SmaI-linearized）（1g）将转化体系分别稀释至1/10、1/100、1/1000、1/10000后，各取100l涂100mm平板。文库转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，对照p53转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200平板。（4）将剩余的所有文库转化混合物（约15ml）涂在150mmSD/-Leu/AbA平板上，每板涂150l。（5）倒置培养3-5d。（6）3-5d后，通过统计SD/-Leu100mm平板上的克隆数目来计算筛选的克隆数。注：所筛选的克隆数至少应该达到1百万，否则会降低筛选到目的产物的可能性。筛选的克隆