源于大肠杆菌蛋白的表达、液相色谱复性与纯化新

中国科学B辑:化学2009年第39卷第8期:711~727源于大肠杆菌蛋白的表达、液相色谱复性与纯化新进展王骊丽,耿信笃*合成及天然功能性分子化学教育部重点实验室,西北大学现代分离科学研究所,陕西省分离科学重点实验室,西安710069*通讯作者,E-mail:[e-mail]收稿日期：2009-06-10;接受日期：2009-06-23摘要对近两年来源于大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)的蛋白表达和用蛋白折叠液相色谱(proteinfoldingliquidchromatography,PFLC)法对所形成的包涵体目标蛋白的复性并同时纯化的新近发展做了简要的介绍和评述.PFLC法用于包涵体蛋白分离、纯化很广,其特点是除了在色谱柱上将目标蛋白与其他组分分开,还同时要在色谱柱上进行包涵体蛋白折叠.可以说,现代生物技术中所用的大多数有价值蛋白产品的制备仍然有赖于不同机理的液相色谱(LC)法.而用PFLC法对源于E.coli的蛋白的制备方法更具可塑性和容易达到规模化,其生成本可以成倍地降低.该文主要内容包括了E.coli蛋白的表达及样品前处理、PFLC的实用范围、PFLC的优化、PFLC中的新技术、新设备和新方法、PFLC的分子学机理、应用事例及对未来的展望.关键词大肠杆菌蛋白折叠液相色谱法蛋白复性蛋白纯化液相色谱生物工程1引言随着基因工程技术的诞生和发展,人们可以通过细菌发酵、真核细胞培养、甚至整体动物培育等多种方式,大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白,用于研究或疾病的治疗.在近二十年来,以酵母、中国仓鼠细胞(CHO)和昆虫等[1]真核细胞表达系统也获得了很大的进展.与真核表达系统相比,大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)克隆表达的原核系统的优点是操作简单,产量高,成本低[2].因此,以E.coli为宿主的表达系统仍然受到研究者的青睐[3].但是,由于真核基因在原核细胞中所表达的产物缺乏翻译后加工,即绝大多数真核细胞蛋白缺少自我复性的能力,在溶液中不能自发形成有活性功能的空间结构,成为不可溶解的、非活性聚集体的包涵体组分[4].包涵体是由错误折叠的多肽形成致密、非晶体性的蛋白沉淀物[5],是蛋白质的高效表达以及变性蛋白质的聚集结果,存在于细菌的细胞质和外周质间隙之间[6].真核基因在E.coli中所表达的蛋白质多肽链在折叠的过程中,在错误折叠的多肽链和正确地折叠成可溶蛋白的分子之间存在着一个动力学过程(图1)[7].图1包涵体形成的动力学过程[7]711王骊丽等:源于大肠杆菌蛋白的表达、液相色谱复性与纯化新进展包涵体体外蛋白质的复性一直是大量生产一些特定的、有生物活性功能的真核蛋白的技术“瓶颈”,也是制约以基因工程蛋白药物为主的生物技术成果走向产业化过程中的主要因素[8].因此如何从所形成的包涵体中提取、复性和纯化目标蛋白就成为科学家一直在致力于要解决的难题[9].而解决此问题,就必须要同时从蛋白质的表达和分离纯化两方面考虑[10].本文拟继前一篇评论之后[11],对从2006年以来,源于E.coli高效表达及其包涵体蛋白在蛋白折叠液相色谱(proteinfoldingliquidchromatography,PFLC)技术方面取得的进展进行评论.2E.coli蛋白的表达及样品前处理通常用基因工程技术从不同的宿主细胞中获得一个具有活性的治疗用重组蛋白药物或者研究用蛋白纯品,其整个过程包括上游技术(基因重组、克隆和表达的设计与构建)和下游技术(基因工程菌或细胞的大规模培养,目标蛋白的分离纯化工艺技术及放大等)两大组成部分.图2是一个从E.col表达包涵体中获得活性功能蛋白的典型工艺路线.众多研究者一直从事于基因工程上、下游的研究工作,以期能寻找出人工辅助包涵体蛋白复性或者说体外蛋白质折叠、再折叠的新方法.从包涵体中获得正确折叠蛋白,首先要将目标蛋白从固态的包涵体中转移到溶液中.因包涵体不溶于水,或盐的水溶液,必须要用极端pH,去污剂,或有机溶剂来溶解.但通常采用高浓度的变性剂8mol/L脲或6~7mol/L盐酸胍的溶液来溶解包涵体,对于含有二硫键的蛋白还要同时加入适量的还原剂如β-硫基乙醇、二硫苏糖醇,以打开蛋白分子内可能错误配对的二硫键以得到单体的多肽链.然后才能对处于分子状态的该变性的目标蛋白进行复性.对处于非折叠状态的多肽链而言,必须首先除去变性剂和还原剂,促使蛋白形成正确对接的二硫键,折叠恢复其天然构象和生物学活性[12].通常认为这个过程并不复杂.但是,到目前为止,已发展了的各种体外辅助蛋白复性方法,如稀释法、透析法[13]、超滤、分子伴侣[14]、小分子添加剂[15]以及LC[16]等体外辅助方法[17].然而,人们在实际研究中却发现,在体外折叠时,由于变性的蛋白分子存在着大量的疏水氨基酸残基,这些疏水氨基酸残基之间的相互作用,形成了图2从大肠杆菌表达包涵体中获得活性功能蛋白的工艺路线蛋白分子的错误折叠和聚集,其包涵体蛋白的复性效率都非常低[18].因此,从一个E.coli中高效表达的包涵体蛋白中获得天然结构并具有天然的生理功能的蛋白质是相当困难的,使以包涵体形式存在大部分蛋白产物成为“看得见,却拿不到”的废品.因此,研究如何能提高包涵体蛋白的复性效率,已经成为成功获得基因工程蛋白药物和解析蛋白质立体结构的关键、具有重大的实际意义.在真核细胞中新生肽链的形成伴随着一系列复杂的加工和成熟过程,昀终才能成为具有生物活性的蛋白质.当然,多学科的交叉和渗透,这就提示人们可以通过基因、载体的不断改造.在设计、构建E.coli所表达蛋白时,就应当融入后续的纯化构想.例如各类的亲和标签[19]、人工分子伴侣[20]、分泌表达的蛋白等[21].即当真核基因在E.coli中表达的形式不同时,选择LC的法也就不同.2.1真核基因在E.coli的表达方式及对包涵体形成的影响目前,真核基因在E.coli中的表达方式主要有三712中国科学B辑:化学2009年第39卷第8期种,细胞不溶性表达、细胞内可溶性和分泌性表达,使外源基因常定位于胞质、周质空间、内膜或外膜和细胞外基质中.在以往大多数的有研究价值和用于生物药物所表达的蛋白质中,主要为细胞内不溶性表达,其表达的蛋白以不溶解性包涵体方式存在,占总数的80%以上.为了克服包涵体的形成,解决所生成的蛋白存在复性困难的问题,探索外源蛋白在E.coli中的细胞内可溶性表达的研究日益增多[22].一类是采用在外源基因表达的同时,共表达分子伴侣和折叠酶(foldases)[23].这些共表达的结果就有可能提供充分的辅助折叠支持[24].如HaackeA等[25]新近又报道利用DnaK-DnaJ-GrpE系统和GroEL-GroES分子伴侣系统,这些分子可以与被折叠的蛋白质相互作用并抑制其形成包涵体或发生聚集,能够促进蛋白质折叠过程中的某些限速步骤,同时增加可溶性蛋白的表达量.PaulS等[26]报道了E.coliGroEL/GroES体外促进蛋白折叠的机制和一个69kDaE.coli麦芽糖苷酶MalZ折叠情况.在ATP水解酶存在下折叠MalZ蛋白使折叠效率提高7倍.肽酰基-脯氨酰基(peptidyl-prolyl)的顺式/反式异构化也能改变细胞内这类分子的相对浓度,对于重组蛋白的折叠和包涵体的形成可发挥重要的影响[27].另一类是通过在分泌过程中切除蛋白质前面的信号肽后使生成的蛋白质的N末端氨基酸残基与天然的产物一致,并在周质的空间中提供了一个氧化的环境,以有利于二硫键的形成[28].此外,通过改变cDNA在被表达的多肽或目的蛋白与强亲和力配体以构成重组的融合蛋白.由于融合系统可以产生大量的可溶性蛋白,因此,使用基因融合表达系统在E.coli中表达外源基因已越来越受到人们的欢迎.如表达β-半乳糖苷酶、谷胱苷肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(Trx)融合蛋白等[29],可以使用对配基蛋白的特异的抗体的亲和色谱(AFC)法能有效的纯化所融合的蛋白[30].朱红裕等[31]全面综述了在E.coli中表达可溶外源蛋白的策略和进展,作者通过这个评述以期提高具有生物活性的外源基因的可溶性表达水平.其中一些发展趋势仍然从表1可以看到,例如应用昀多还是pET系统的表达载体、融合蛋白的高效表达.因此,获得细胞内可溶性表达系统和高效分泌表达系统进行高表达,就能够方便地利用LC法从培养基中分离出目的外源蛋白,并且容易达到规模化.2.2高效表达的蛋白对包涵体形成的影响E.coli的高密度培养是增加重组蛋白产率的昀有效的方法.在增加菌体密度的同时提高蛋白的表达量,可使形成的包涵体包裹得更紧密,包涵体内目标蛋白也较纯,从而有利于简化下游的纯化工艺[62].不同的E.coli菌株在培养条件(温度、培养基组成、诱导剂选择)和目的基因的表达能力上差异很大.因此,研究者一方面通过降低诱导系统的成本,优化每个表达系统来实现高密度、高表达,达到工业化生物工艺的目的.如采用化学诱导剂(IPTG)诱导表达重组菌时,其细胞生长的温度控制在37℃左右时,结果80%以上E.coli表达的外源蛋白都生成包涵体的形式[63].而另一方面人们又通过改变蛋白质的性质以及所处环境条件,如在发酵过程中增加可溶性表达来减少包涵体的形成,减低目的基因的过度表达和下游过程操作成本.Huang等[64]在控制的流加培养体系中研究了发酵E.coli重组D-乙内酰脲酶的培养条件对形成包涵体的影响,在诱导表达时调节培养温度32~27℃,在此温度下维持质粒稳定生长以避免包涵体的形成.在低温条件下诱导表达,可减少包涵体的形成,所表达产物大部分存在于破碎后的上清液中,使后续的纯化手续简化.Arie等[65]的实验却获得了意外的结果,突变的E.coli麦牙糖共聚物蛋白(MalE31)在30℃培养不影响包涵体的形成,37℃形成致死因子,但当温度升高到42℃诱导表达时,包涵体形成降解促使E.coli细胞继续生长.因此,从这些结果提示,E.coli中包涵体的形成一种可能是在低温下蛋白质的合成速度减慢使折叠的速度也减慢.这样,就有更多的机会进行正确的折叠,从而会减少包涵体的形成[66].另一种可能与外源蛋白在生成的过程中,缺少某些协助因子或由于周围的物理环境不适有关,使其难以连续进行次级键的形成,中间产物相互凝集而积累成包涵体[67].可以看出,蛋白诱导表达过程机制是非常复杂的.也有研究发现在诱导时期,流加方式的改变也有可能显著提高可溶性蛋白的表达量[68].但是,过度地使可溶解性的增加,又可使发酵713王骊丽等:源于大肠杆菌蛋白的表达、液相色谱复性与纯化新进展表12006~2009年PFLC复性与纯化蛋白实例a)复性蛋白来源或宿主填料类型复性与纯化方法产品纯度(%)复性蛋白效果比活性或生物活性出版年文献rhG-CSFDH5αCu2+AFC97Amassrecovery39%2.3×108IU/mg2009[32]TRAILBL21(DE3)Ni-NTAAFC/SEC98N.R.N.R.2009[33]α-ChyPurchasedPEG-600HICN.R.N.R.N.R.2009[34]hApaf-1BL21(DE3)SephadexG100SEC~100N.R.N.R.2009[35]rhG-CSFDH5αSuperdex75SEC83Amassrecovery30%1.2×108IU/mg2008[36]hDrll1BL21(DE3)GSTrapAFC/SEC≥95N.R.N.R.2008[37]rhIFN-γDH5αPEG200HIC/SEC95Amassrecovery92%9.5×108IU/mg2008[38]rhMKBL21(DE3)S-SepharoseIEC986.2(protein)N.R.2008[39]ATF5BL21(DE3)GSTrapAFC/ultrafilterN.R.Totalp