动物实验基本技术和方法

动物实验基本技术和方法广东药学院实验动物中心主要内容一、实验前准备二、实验动物抓取与固定三、年龄的大致判断四、性别、发情、与妊娠鉴定五、编号和标记六、分组七、去毛八、给药途径与方法九、采血方法十、其他体液采集十一、麻醉方法十二、处死方法十三、动物病理检查一、实验前准备理论准备：了解动物实验基础知识制定研究计划和方案查阅关于实验方法的参考文献条件准备：仪器、器械、药品运输动物实验和饲养场所二、实验动物抓取和固定（一）小鼠小鼠固定器固定（二）大鼠大鼠固定盒固定（三）豚鼠（四）家兔兔子固定器固定狗钳狗的抓取固定（五）犬犬嘴固定方法猫的抓取犬固定（六）猴抓取与保定猴徒手固定三、年龄的大致判断（一）大、小鼠1、根据形态鉴定日龄（大、小鼠情况基本一样）日龄/d外观形态特征1仔鼠裸体鲜红3耳壳露出表皮4脐带瘢痕脱落5能翻身8能爬行日龄/d外观形态特征10能听到声音9～11全身被白毛，门齿长出13～15眼皮张开，能跳跃，能抓取东西18以后能自行采食，独立生活2.根据体重鉴定日龄⑴小鼠日龄与体重的对应日龄/d初生51015202530体重/g1.84.06.011.015.021.024.0⑵大鼠日龄与体重的对应日龄/d初生10203040体重/g6～717～2535～5055～90100～150日龄/d50607080体重/g150～210170～240210～270240～320（二）豚鼠一般老年豚鼠牙齿和趾爪长，被毛稀疏无光泽，眼神呆滞，行动迟缓。而年轻豚鼠牙齿短白，爪短软，眼睛圆亮，行动敏捷，被毛有光泽，且紧贴身体。同样，也可根据体重来推断大致年龄。同日龄豚鼠，雌性体重略高于雄性。与大鼠一样，其体重受多种因素的制约。实验对年龄要求比较严格时，必须由卡片记录提供准确年龄。日龄/d初生7203060体重/g60～80100～120150～200170～220240～300日龄/d90120180体重/g330～400400～470520～600（三）家兔家兔的门齿和爪随年龄增长而增长，是年龄鉴别的重要标志。青年兔门齿洁白，短小，排列整齐；老年兔门齿暗黄，厚而长，排列不整齐，有时破损。白色家兔趾小基本呈红色，尖端呈白色。1岁家兔红色与白色长度相等；1岁以下，红多于白；1岁以上，白多于红。还可根据趾爪的长度与弯曲度来区别。青年兔趾爪较短，直平，隐在脚毛中，随年龄的增长，趾爪露出于脚毛之外，而且爪尖钩曲。另外，家兔皮薄而紧，眼神明亮，行动活泼的为青年兔；皮厚而松，眼神颓废，行动迟缓的为老年兔。（四）犬犬的年龄主要以牙齿的生长情况、磨损程度、外形颜色等情况综合判定。仔犬在出生后十几天即开始生出乳齿，2个月以后开始由门齿→犬齿→臼齿顺序逐渐更换为恒齿，8～l0个月齿换齐。但犬齿需要1岁半以后才能长坚实。饲养场饲养的品种犬，可以根据记录，明确了解年龄，而收购的杂种犬就无法知道确切年龄。实际中，可根据犬齿更换和磨损情况，估计犬的年龄。年龄犬齿更换和磨损情况2个月以下仅有乳齿(白、细、尖)2～4个月更换门齿4～6个月更换犬齿(白，牙尖圆钝)6～10个月更换臼齿1岁牙长齐，洁白光亮。门齿有尖突2岁下门齿尖突部分磨乎3岁上、下门齿尖突大部分磨平4～5岁上、下门齿开始磨损呈微斜面，并发黄6～8岁门齿磨成齿根，犬齿发黄、磨损9～10岁唇部、胡须发白10岁以上门齿磨损，犬齿不齐全，牙根黄，唇边胡须全白四、性别、发情、与妊娠鉴定（一）大、小鼠的性别鉴定初生兔仔如阴部孔洞扁圆而略大于肛门，且与肛门相向、距离较近的是母兔；孔洞呈圆形而略小于肛门，孔洞向前而距肛门较远的是公兔。三月龄以上的兔子，只要看有无阴囊即可区别公母。（二）兔的性别鉴定FemaleMale（三）大、小鼠发情鉴定小鼠性周期阴道分泌物涂片变化阶段持续时间（h）涂片可见卵巢变化动情前期9-18大量有核上皮细胞少量角化上皮细胞卵泡加速生长动情期6-12满视野角化上皮细胞，少量有核上皮细胞卵泡成熟、排卵动情后期30-48角化上皮细胞及白细胞黄体生成动情间期36-42大量白细胞及少量粘液黄体退化（四）妊娠鉴定1、阴道栓法（大、小鼠、豚鼠）2、外部检查法3、摸胎法4、阴道检查法5、直肠检查法6、超声波检查法7、孕酮含量测定法阴道栓五、编号和标记1、染色法：浅色动物3.5-5％苦味酸溶液（黄色）0.5%中性红或碱性品红溶液（红色）煤焦油酒精溶液（黑色）龙胆紫溶液（紫色）2、打耳孔法：小型动物3、剪趾法：小型动物4、剪尾法：大、小鼠，仅限与两组间区分5、烙印法：刺号钳，中、大型动物6、针刺法：中、大型动物7、号牌法：耳标签、项圈、腿圈，中、大型动物8、剪毛法：大动物9、笼子标号六、分组随机化分组：避免人为影响例：将14只小鼠随机分成两组。①先将小鼠编为I～14号，②在随机数字表上任点一数，按任意方向连续抄14个随机数字。编排如下：动物编号1234567891011121314随机数字1622779439495443548217379323归组BBABAABABBAAAA③奇数代表A织，偶数代表B组④A组：356811121314B组：1247910⑤调整分组：接刚才随机数字23继续抄表得随机数字78，用78除以8（因为需要把A组的8个数字调整掉一个），得余数6，所以把A组的第6个动物，即12号动物调整到B组⑥最终分组A组：3568111314B组：124791012例：12只大鼠随机分为3组①大鼠编号1~12②在随机数字表上任点一数，按任意方向连续抄12个随机数字。③每个数分别用3除，记录余数，④根据余数分组大鼠编号：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12随机数字：08，27，01，50，15，29，39，39，43，79，69，10余数：2，0，1，2，0，2，0，0，1，1，0，1组别：B，C，A，B，C，B，C，C，A，A，C，A⑤A：3，9，10，12B；1，4，6C：2，5，7，8，11⑥调整分组：接刚才随机数字10继续抄表得随机数字61，用61除以5（因为需要把C组的5个数字调整掉一个），得余数1，所以把C组的第1个动物，即2号动物调整到B组。⑦最终分组A：3，9，10，12B；1，2，4，6C：5，7，8，11七、去毛1、剪毛：弯头剪毛剪。2、拔毛：大小鼠尾静脉、家兔耳缘静脉注射。3、剃毛：将剃毛部位先用剪刀粗剪一遍，蘸温肥皂水润湿，用剃刀顺着被毛方向剃毛，用电动剃毛推剪，则逆被毛向剃毛。4、化学脱毛：常用脱毛剂①8%硫化钠水溶液②硫化钠3份，洗衣粉1份、淀粉7份，加水调成糊状③硫化钡50克，氧化锌25克，淀粉25克，加水100毫升调成糊状④硫化钠10克，生石灰15克，加水到100毫升，适合犬和其他大动物。八、给药途径与方法（一）自动口服：加入饲料或饮水（二）投喂药片：掰开口，放到舌根部（三）灌胃（i.g)1、小鼠、大鼠、豚鼠灌胃时将灌胃针按在注射器上，吸入药液。左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动物固定，右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿咽后壁徐徐插入食道。动物应固定成垂直体位，针插入时应无阻力。若感到阻力或动物挣扎时，应立即停止进针或将针拔出，以兔损伤或穿破食道以及误入气管。一般当灌胃针插入小鼠3～4cm，大鼠或豚鼠4～6cm后可将药物注入。常用的灌胃量小鼠为0.2～1ml，大鼠1～4ml，豚鼠为1～5ml。2、狗、兔、猫、猴灌胃时，先将动物固定，再将特制的扩口器放入动物口中，扩口器之宽度可视动物口腔大小而定，如狗的扩口器可用木料制成长方形，长约10～15cm，粗细应适合狗嘴，约2～3cm，中间粘一小孔，孔的直途为5～10cm。灌胃时将扩口器放于上述动物上下门牙之后，并用绳将它固定于嘴部，将带有弹性的橡皮导管（如导尿管），经扩口器上的小圆孔插入，沿咽后壁而进入食道，此时应检查导管是否正确插入食道，可将导管外口置于一盛水的烧杯中，如不发生气泡，即认为此导管是在食道中，未误入气管，即可将药液灌入。灌胃管插入长度狗为20cm，兔子为12-15cm。动物最大灌胃量（四）直肠给药（五）呼吸道给药（六）滴鼻（七）点眼（八）经皮肤给药：常用于检测药物、毒物、化妆品等的透皮吸收、局部作用、至敏作用等。家兔和豚鼠选择脊柱两侧皮肤，大小鼠常采取浸尾方式。（九）皮内注射(i.d)：一般用于接种或过敏实验。将药液注射在真皮和表皮之间。皮内注射时需将注射的局部脱去被毛，消毒后，用左手拇指和食指按住皮肤并使之绷紧，在两指之间，用注射器连4(1/2)号细针头，紧贴皮肤表层刺入皮内，然后再向上挑起并再稍刺入，即可注射药液，此时可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。（十）皮下注射(s.c)：注射时以左手拇指和食指提起皮肤，将连有5（1/2）号针头的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、猫多在大腿外侧，豚鼠在后大腿的内侧或小腹部；大白鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。（十一）肌肉注射(i.m)：股部肌肉（十二）腹腔注射(i.p)：用大、小白鼠做实验时，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。若实验动物为家兔，进针部位为下腹部的腹白线离开1cm处。（十三）静脉注射(i.v)：1、小鼠：尾静脉2、大鼠：尾静脉、阴茎静脉、舌下静脉、浅背侧跖静脉大小鼠有上、左、右3根尾静脉，成品字型小鼠尾静脉注射大鼠阴茎静脉注射大鼠舌下静脉注射大鼠浅背侧跖静脉注射3、豚鼠：浅背侧跖静脉、耳静脉注射4、家兔：耳静脉注射5、猪：耳缘静脉6、猴：前肢桡静脉、后肢隐静脉注射猪耳缘静脉注射7、猫、狗：前肢内侧头静脉、后肢外侧小隐静脉注射狗前肢内侧头静脉狗后肢外侧小隐静脉猴的后肢皮下静脉注射（十四）脑腔注射：1、小鼠小指夹鼠尾，拇指和是指置小鼠头两侧固定，中指和无名指压住鼠身，在注射处消毒后，右手持注射器，以食指固定针芯，垂直刺入针头深度约5～7mm。2、兔将兔用固定器固定好，剃去头顶的被毛，左手将头皮绷紧，消毒后，右手持锥子，自头顶正中稍偏一侧部位，锥穿头骨，即换以左手固定锥子，右手持注射器，使针头沿锥尖刺入，慢慢拔出锥子，即刻将针头刺入约10～20mm，即可推液。（十五）关节腔注射：（十六）椎管内注射：注射入蛛网膜下腔（十七）淋巴囊内注射：蛙和蟾蜍（十八）小脑延髓池注射：几种动物不同给药途径的常用注射量（毫升）注射途径小鼠大鼠豚鼠兔狗腹腔0.2～1.01～32～55～105～15肌肉0.1～0.20.2～0.50.2～0.50.5～12～5静脉0.2～0.51～21～53～105～15皮下0.1～0.50.5～10.5～21～33～10九、采血方法（一）大、小鼠：1、眶静脉丛（窦）：少量多次采大小鼠血。小鼠0.2～0.3ml，大鼠0.4～0.6ml2、摘眼球：用于一次大量采小鼠血，可得到4～5％体重的血量3、尾静脉：用于少量多次采大小鼠血尾静脉采血4、剪头：用于一次性大量采小鼠血，可得到0.5～1.0ml的血量5、大血管：包括颈动脉（静脉），股动脉（静脉），腋下动脉（静脉），腹主动脉，此方法不常用于小鼠采血，而多用于大鼠一次性大量采血。可得5ml左右血量。6、心脏采血：小鼠少用，可用于大鼠一次性（开胸）或多次采血（不开胸）。心脏采血（二）家兔：1、耳缘静脉：中等血量的采集，可反复采血，每次5～10ml。2、耳中央动脉：可反复采血，每次10～15ml。3、心脏采血：可用于一次性（开胸）或多次采血（不开胸）。一次性开胸采血可得到80～100ml血量4、颈动静脉采血：用于一次性采血，需要手术，可得血量80～10ml。（三）豚鼠：1、心脏采血：可用于一次性（开胸）或多次采血（不开胸）。一次性开胸采血可得到5～10ml血量。2、背跖静脉采血：用于少量反复采血。3、耳缘剪口采血（四）犬猫：和静脉注射部位相同，前肢内侧头静脉、后肢外侧小隐静脉。也可颈静脉（动脉）或心脏采血。（五）猪：前腔静脉或耳大静脉采血（六）羊：颈静脉采血（七）猴：前肢头静脉、后肢