丙二醛(MDA)含量的测定

丙二醛（MDA）含量的测定丙二醛是膜脂过氧化最重要的产物之一。植物在逆境下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切相关。植物生理学实验课件•植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（MDA：Malondialdehyde）是膜脂过氧化最重要的产物之一，因此可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。原理丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川），该物质在532nm处有一吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收。根据其532nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。醛、可溶性糖对此反应有干扰，在450nm处有一吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。原理+100COHNSNHOOOHHHNHSNHOOHOOHNNHS2O硫代巴比妥酸丙二醛3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川）仪器设备1.分光光度计；2.研钵；3.剪刀；4.恒温水浴；5.试管：20mL×46.离心机。试剂1.5%三氯醋酸；2.0.5%硫代巴比妥酸（用5%三氯醋酸溶解定容）；3.0.05mol·L–1磷酸缓冲液，pH7.8。材料•正常生长的以及经逆境处理的小麦、玉米或其他植物的叶片。方法与步骤1．取小麦植株上不同叶位的叶片3~5片，洗净擦干，剪成0.5cm长的小段，混匀。2．称取叶片切段0.3g，放入冰浴的研钵中，加入少许石英砂和2mL0.05mol·L-1磷酸缓冲液，研磨成匀浆。将匀浆转移到试管中，再用3mL0.05mol·L-1磷酸缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。3．在提取液中加入5mL0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀。4．将试管放入沸水浴中煮沸10min，（自试管内溶液中出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放入冷水浴中。5．待试管内溶液冷却后，3000×g离心15min，取上清液并量其体积。以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白测532nm、600nm和450nm处的消光值。计算结果•式中，Vt：提取液总体积（mL）；•Vs：测定用提取液体积（ml）；•FW：样品鲜重（g）。-1t532600450VMDAmmolgFW=6.452DD0.559DVWs注意事项•1．可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。•2．低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5nmol·L-1）•3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。思考题•不同植物在同一逆境下，丙二醛含量变化不同，说明了什么？