5-临床分子检测：性能验证与性能确认

临床分子检测：性能验证与性能确认李金明国家卫生计生委临床检验中心2017.3.29.江苏基因扩增培训班？性能验证（verification）？性能确认（validation）？性能验证与性能确认有何区别？性能验证的5W（Why、What、When、Where、Who）1H（How）？LDTs及其国内外监管？“性能验证”（“verification”）定义“verification”：broadlyas“confirmationthroughtheprovisionofobjectiveevidence,thatspecifiedrequirementshavebeenfulfilled”.（广义为通过提供客观证据证明特定的要求得到满足）CLIAusestheterm“verification”：specificallytorelatetoconfirmationthatthelaboratoryusingatestcanreplicatethemanufacturer’sperformanceclaimswhenthetestisusedaccordingtothepackageinsert.（CLIA性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。）“性能确认”（“validation”）定义TheFDAandISObothdefinetheterm“validation”as“confirmationbyexaminationandprovisionofobjectiveevidencethattheparticularrequirementsforaspecificintendedusecanbeconsistentlyfulfilled”.（通过检查和提供客观证据证明，对一特定预期应用的要求始终能得到满足）TheFDAandISOtermsforverificationandaresimilar,withthedistinctionhavingtodowithintendeduse.（性能验证和性能确认FDA和ISO术语相似，差异在后者的“预期用途”）“intendeduse”预期用途Theterm“intendeduse”inthesedocumentsisestablishedbythemanufacturerordevelopinglaboratoryatthetimeofassaydevelopmentandhastodowiththepurposeandpopulationforwhichthetestwasintended(e.g.,diagnosis,followingtreatment,etc.).Relevantperformancecharacteristicsarethendeterminedbasedontheintendeduseofthetest.Somepeopleinterpret“intendeduse”asreferringtotherelevantclinicallaboratoryinwhichthetestisperformed,ratherthanthemanufacturerordevelopinglaboratory,thuscausingconfusion.TheWorldHealthOrganization(WHO)definesvalidationas“theaction(orprocess)ofprovingthataprocedure,process,systemequipmentormethodusedworksasexpectedandachievestheintendedresult”.（WHO将validation定义为，证明所使用的一个程序、过程、系统设备或方法能按预期进行工作以及取得预期结果的活动（或过程））分子遗传检测可能的预期用途筛查诊断预测(特定情况下)?靶向治疗药物选择治疗监测预后“validation”通俗一点的定义theterm“validation”willbeusedtorefertotheanalyticperformancecharacteristicsthatneedtobeinitiallyestablishedatthetimeofassaydevelopment.（指在测定方法研发时，最早建立的分析性能特征）性能验证与性能确认的实际操作区别性能指标及所建议的研究要求FDA批准的检测实验室自建方法或自配试剂（LDT）可报告范围,线性范围研究(定量检测)覆盖所述线性范围内5~7个浓度，每个浓度双份检测覆盖预计测定范围内（或超出所确定的最宽的可能范围的20〜30%）7~9个浓度，每个浓度2~3个重复检测，进行多项回归分析分析敏感性，测定下限（LOD）研究CLIA不要求，但CAP要求对定量进行LOD验证，使用在5天内收集的20个数据点60个数据点（例如在预计的检测下限范围内5个样本，12次重复），研究时间5天，使用probit回归分析（或如果采用LOB研究，则使用SD加置信限）精密度,重复实验定性检测：检测1个对照/天，共20天，或双份重复/天，共10天。定量检测：2个浓度的每1个检测2个样本（共4个样本），加1个对照，检测20天，或检测2个浓度，3管重复，检测5天定性检测：最少3个浓度（LOD、LOD+20%、LOD-20％），获得40个数据点。定量检测：最少3个浓度（高、低和LOD），双管重复检测1~2次/天，检测20天，计算批内、批间、每天之间SD和/或CV，以及总的变异分析特异性,干扰研究CLIA不要求未建议最小样本数量；检测样本相关的干扰物质（溶血、脂血、黄疸等）和遗传上相似的微生物或具有相同临床表现同一样本位点可见到的微生物，加入低浓度待测物质。采用t检测统计分析。准确度（正确度），方法学比较研究在检测范围内的20个患者样本或2个浓度（低和高）标准物质，复管检测2~5批。使用比较方法和拟评价方法至少5天进行双管重复检测，典型的40个以上的样本，进行xy散点回归统计分析；采用Bland-Altman差异描点，加偏倚测定;使用kappa统计学分析%符合率参考区间厂家说明书内提出的参考区间在特定实验室用于其所服务的人群时可能会发生“改变”，如果实验室希望进行验证，检测可代表相应人群的20份样本，如果人群完全不同，则通过要60份（至少40）建立参考区间。如果在健康个体靶核酸不会存在，则属于定性检测，参考范围为“阴性”或“未检测到”，则不需要进行参考区间研究。对于定量检测，参考区间可报告为低于最低检测限（LOD或LLOD）；对于某些待测物，参考区间可能是一个临床决策限（aclinicaldecisionlimit）；如果检测的预期用途限于已知被检测的待测物是阳性的患者，则不适用参考区间。注：所有性能确认和性能验证研究必须使用于适当基质中制备的样本，必须对检测的所有样本类型以及每种基因型和多重检测中的每种待测物进行评价。BurdEM.ClinMicrobiolRev.2010性能验证的5W1H？为什么要验？（Why）什么时候验？（When）验什么？（What）在哪里验？（Where）谁来验？（Who）如何验？（How）高速列车性能验证空气动力学速度车体转向架运行固定、悬挂的零部件强度稳定性舒适感故障率……Why？When？使用新的检测试剂或系统时What？精密度（重复性）准确性（正确度，方法学比较）可报告范围（线性范围）参考区间分析敏感性（测定下限）分析特异性抗干扰能力临床特异性和临床敏感性？Where?厂家或他单位的实验室可以吗Who?厂家工程师可以吗How？概念准备专业知识技能准备样本准备性能验证SOP准备性能验证的合格标准从何而来？试剂盒说明书（先决条件！）国际和／或国内标准？CLIA“性能验证”：特指使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。分析敏感性（质粒）中文简译样本：6个最常见突变的质粒，与野生的细胞系DNA混合成含5%突变的浓度，再对5%突变的样本进行系列稀释。样本稀释液：野生的细胞系DNA方法：对每种含5%突变的上述样本用稀释液稀释成6个独立的系列，每一稀释浓度24个样本，每个系列使用3个不同比试剂检测，每批试剂进行24个重复检测，每一浓度样本得到72个结果LOD计算：有95%检出的最低突变浓度即为检测下限（表3）。分析敏感性（检测下限）（使用质粒样本）分析敏感性（蜡埋样本）中文简译样本：EGFRExon19del和L858R突变各3个FFPET标本，分别用EGFR野生型FFPET提取的DNA系列稀释成含10%、5.0%、2.5%和1.25%突变的样本，突变比例采用高通量测序（454）验证。样本稀释液：野生的细胞系DNA方法：每个系列使用3个不同比试剂检测，每批试剂进行8个重复检测，每一浓度样本得到24个结果LOD计算：有95%检出的最低突变浓度即为检测下限（表4）。写基因突变分析敏感性验证的SOP了吗？分析敏感性（检测下限）（使用FFPET样本）准确度（与参考方法测序比较）与Sanger测序比较测定范围分析特异性、抗干扰能力、重复性中文简译样本：6个FFPE样本，包括2个野生型样本，4个突变样本（分别为Exon19del、S786I、G719X和Exon20插入突变）方法：由2个操作者，对上述样本用2批试剂，两台CobasZ480分析仪，4天内双管重复检测，正确检测率为98%（188/192）会写基因突变检测重复性验证的SOP了吗？重复性？定性检测性能验证至少要验证哪些指标？重复性（精密度）、检测限（分析敏感性）如果使用的是国产试剂盒，性能指标不清晰，如何验证？参考上述国外试剂盒说明书编与SOP进行验证LDTs及国内外监管简介LDTs可分为三类生产厂家未提供性能指标的试剂或检测系统FDA注册或批准的试剂或检测系统，但实验室进行了修改未经FDA注册或批准的试剂或检测系统LDTs的“美国”定义指在CLIA认证的实验室内研发的用于患者疾病诊疗的检测方法和试剂，仅限于研发该LDT的实验室使用。CodeofFederalRegulations2009Title42.Publichealth,Vol4,ChapterV美国FDA对体外诊断产品的监管体外诊断产品（invitrodiagnosticdevices，IVDs)定义：为用于疾病诊断或包括为治疗或预防疾病确定患者健康状态的其它目的的试剂、仪器和系统，并作为商品销售。在美国，1976年的联邦食品、药品和化妆品医学产品法案修正案（The1976MedicalDeviceAmendmentstotheFederalFood,DrugandCosmeticAct,FD&CA)授权美国FDA监管包括体外诊断产品（IVDs)在内的医学产品。根据其对患者的风险评估分为三类，I类为低风险，用于患者前，不需要评估或批准；Ⅱ类为中度风险，进行一般和特定的控制，常需通过进入市场前的告知方式或者510（K）过程由FDA进行评估；Ⅲ类为高风险，则需要进入市场前的批准（premarketapproval,PMA)程序。一般的药物遗传检测属于Ⅱ类。加拿大对IVDs的监管加拿大则将IVDs的风险分为四级遗传检测归为Ⅲ类，即对公众健康有中等风险或对个体有高风险。欧盟对IVDs的监管欧盟则制定了“体外诊断医学产品指令”（theInVitroDiagnosticMedicalDevicesDirective(CouncilDirective98/79/EC)）,作为欧盟对IVDs监管的要求。设定了最低安全、质量和性能标准，但具体评价由各成员国的监管机构进行，一旦通过一个国家的批准，则全欧盟成员国通行有效。国内对IVDs的监管在国内，