第二章-植物组织培养的培养条件

第二章植物组织培养的条件GenotypeEnvironmentPhysiologyPhenotype第一节植物组织培养的条件1.植物组织培养最基本的前提条件：用于培养的外植体细胞必须具有全能性2.离体隔离3.适宜的培养条件环境条件：光照、温度、湿度。营养条件：培养基。一、环境条件植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培养都是在23-27℃之间进行，一般采用25土2℃。温度•组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面：★一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。一般光照强度为1000~5000lx★光周期，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。★光质，对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。光照Lightxhormoneresponses:InvitrorootingofPrunusinsititaLightColour+NAA-NAAWhite10081FarRed9310Red100100Blue3671Darkness1005(FromRossietal.,1993)•湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内湿度要保持在99%左右，环境的相对湿度一般要求70％-80％的相对湿度。湿度其它因素渗透压•培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压以上植物细胞就不能生存。其它因素通气状况氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。◆固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。◆液体培养时，可考虑采取振荡培养的方式，以增加通气性。二、营养条件——培养基培养基：是离体培养的组织或者细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似于生物体内生存的营养环境，满足其正常生长和维持其完整结构及功能。无机盐类：大量元素：C、H、O、N、P、K、S、Ca、Mg微量元素：Mo、Co、Mn、Cu、Zn、Fe等有机营养：碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖氮源：氨基酸类、酰胺类活性物质：维生素类、肌醇、生物素等生长调节物质：生长素类：IAA、NAA、IBA等细胞分裂素类：激动素、玉米素等其它类：赤霉素、脱落酸、乙烯固化剂：琼脂、明胶、卡拉胶等培养基的组成•元素名称添加形式NKNO3,NH4NO3大量元素PKH2PO4,NaH2PO4KKCl,KNO3,(≥0.5mmol/LCaCaCl2·2H2O,Ca(NO3)2·4H20或100mg/l)MgMg2SO4·7H2OSMg2SO4·7H2O,Na2SO4微量元素FeFe-EDTA(Na2-EDTA+FeSO4·7H2O)BH3BO3MnMnSO4·7H2O(≤0.5mmol/L)CuCuSO4MoNa2MoO4·2H2OZnZnSO4·7H2OIKICoCoCl3MurashigeandSkoogstocksolutions(MSMedium)MacroelementsMicroelements(0.5mmol/L)(0.5mmol/L)MgSO4.7H2O0.37g/lKI0.83mg/lNH4NO31.65g/lH3BO36.2mg/lKNO31.9g/lMnSO4.4H2O22.3mg/lCaCl20.33g/lZnSO4.7H208.6mg/lKH2PO40.17g/lNa2MoO4.2H2O0.25mg/lCuSO4.5H2O0.025mg/lCoCl2.6H2O0.025mg/lNa2.EDTA37.3g/lFeSO4.7H2O27.8mg/lMSsaltsreducedto0.47g.l-1MSsaltsincreasedto9.52g.l-1培养基对非洲紫罗兰组织培养的影响Control碳水化合物•选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等•蔗糖浓度：使用量1-5%，常用量为2－3%，幼胚培养可提高到4－15%•蔗糖具有热易变性，高压灭菌后部分糖会分解。•蔗糖在培养基中的作用：1.为培养物提供能源和碳骨架2.可以调节培养基的渗透压Nosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%培养基对非洲紫罗兰组织培养的影响种类：VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、VB3（烟酸）、Vc、生物素、叶酸浓度：0.1－1.0mg/L作用：VB1全面促进生长，提高活力VB6促根生长Vc抗氧化作用，防组织褐变维生素肌醇促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成对组织细胞繁殖、分化的促进作用浓度100mg/L椰乳：促愈伤组织和细胞培养，用量10－20%，香蕉泥：对PH值缓冲大，用量150－200ml/L马铃薯：对PH值缓冲大，用量150－200g/L，有利壮苗水解酪蛋白：浓度100－200mg/L，应用在微茎尖培养天然复合物Auxins——生长素诱导细胞的分裂和根的分化溶于95%乙醇或1mol/LNaOHNoNAANAAreducedto0.1mg.l-1NAAincreasedto5.0mg.l-1培养基对非洲紫罗兰组织培养的影响Cytokinins——细胞分裂素促进细胞分裂和由愈伤组织形成器官，分化不定芽。溶于1mol/L的HCl细胞分裂素类(cytokinin)•（1）种类：6－BAKTZT•（2）作用：诱导不定芽分化和茎、苗增殖。•（3）浓度：0.05－10.0mg/L①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长②促进细胞分裂与扩大。③抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。NoBABAreducedto0.1mg.l-1BAincreasedto5.0mg.l-1培养基对非洲紫罗兰组织培养的影响激素配比模式•生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向（形成愈伤组织；长根；长芽）。高有利于根的形成生长素/细胞分裂素和愈伤组织的形成适中有利于根芽的分化低有利于芽的形成HIGHHIGHAUXINCYTOKININSEQUALAMOUNTSGA(gibberellicacid)赤霉素•（1）种类：分别从植物,真菌和细菌中已经发现赤霉素类物质超过140种.GA3是目前主要的商品化和农用形式。（2）作用：促进幼苗茎伸长，促进不定胚发育成小植株；添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。培养体支持材料•1.琼脂A用量6－10g/LB新买应试凝固力培养方式固体培养液体培养营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性差。通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长发育不整齐。活性炭在植物组织与细胞培养中的作用•活性炭可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5—羟甲基糖醛及激素等。•活性炭对于在茎尖初代培养时可吸附外植体产生的致死性褐化物（吸附酚类化合物时的适宜浓度是0.1-0.5%)；•减弱光照促进生根；•此外，在培养基中加入0.3%活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用，活性炭在胚胎培养中也有一定作用活性炭MS培养基特点：无机盐浓度高、元素间比例适当,离子平衡性好，具有较强的缓冲性，是目前使用最广泛的培养基。无机盐、有机成分含量较低，适用于生根培养。White培养基特点：一、常用培养基特点B5培养基特点：含较高的NO3-N，氨态氮含量较低，含有较高的硫胺素（VB1）较适用于一些要求较高氮素营养的植物培养，如常见木本植物双子叶植物组培的选择一、常用培养基特点N6培养基特点：成分简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高，适合花药培养,尤其适合禾本科植物的组织培养。一、常用培养基特点第三节培养基的配制二、培养基制备（一）母液配制与保存（二）培养基配制MurashigeandSkoog(MS)MediumMacroelementsMicroelements(0.5mmol/L)(0.5mmol/L)MgSO4.7H2O0.37g/LKI0.83mg/LNH4NO31.65g/LH3BO36.2mg/LKNO31.9g/LMnSO4.4H2O22.3mg/LCaCl20.33g/LZnSO4.7H208.6mg/LKH2PO40.17g/LNa2MoO4.2H2O0.25mg/LCuSO4.5H2O0.025mg/LCoCl2.6H2O0.025mg/LNa2.EDTA37.3g/LFeSO4.7H2O27.8mg/L一、母液的配制与保存培养基母液：培养基各类溶液的浓缩液。一、母液的配制与保存•培养基母液：配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取。一般母液配成比所需浓度高。•常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类和激素类分别配制成比培养基浓度高10-100倍的母液，低温保藏。一、母液的配制(以MS为例)•(一)母液配制要求：•1.母液浓缩倍数：大量元素10×;微量元素10×、铁盐100×;有机物50－100×.•2.选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂•3.防止沉淀•4.激素母液配制•混配法配制母液：配制母液时为减少工作量，将几种药品配在同一母液中。•通常大量元素、微量元素、有机物均可采用混配方法配成浓缩一定倍数的母液。collectingtheingredients无机盐１L培养基中用量(mg)称取量（g）定容体积KNO3190019分别溶解后混合定容至1000ml。NH4NO3165016.5MgSO4·7H2O3703.70KH2PO41701.70CaCl2·2H2O4404.40大量元素母液（扩大10倍）•注意：为避免发生沉淀，应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序。•母液的浓度可用aml/L表示，其意义为：配制1升培养基吸取该母液a毫升。MurashigeandSkoog(MS）MediumMgSO4.7H2O0.37g/LKI0.83mg/LNH4NO31.65g/LH3BO36.2mg/LKNO31.9g/LMnSO4.4H2O22.3mg/LCaCl20.33g/LZnSO4.7H208.6mg/LKH2PO40.17g/LNa2MoO4.2H2O0.25mg/LCuSO4.5H2O0.025mg/L甘氨酸2mg/LCoCl2.6H2O0.025mg/L盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/LNa2.EDTA37.3g/L烟酸0.5mg/LFeSO4.7H2O27.8mg/L肌醇100mg/L•铁盐的配法:Fe2+在培养基中不稳定，故要用螯合剂Na2－EDTA来配制，配制方法如下：在装有400ml蒸馏水的烧杯中加入2粒苛性钠，溶解后加入3.73gNa2–EDTA,加热使其全部溶解，然后边搅拌，边慢慢加入2.78gFeSO4·7H2O直至全部溶解,冷却后定容至1000ml（浓度10ml/L)，倒入棕色试剂瓶中，置于冰箱中冷藏，保存备用•单配法配制母液：对于激素类等针对不同培养物需要调节用量的物质可配成单一化合物的母液。•这种母液的浓度一般用amg/ml。其意义为：每毫升母液中含有a毫克溶质。•某种激素母液浓度为0.25mg/ml，如果要配制该激素为0.5mg/l的MS培养基1L，则应吸取该激素母液ml。•激素母液的配制:激素类物质一般都难溶于水,在溶解时要借助其它溶剂使其能溶于水中.细胞分裂素类一般先用少量1N盐酸溶解后,再加入温水冷却后定容生长素类一般先用少量1NNaOH或酒精溶解后,再加入一定量的温水,冷却后定容。•配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制1L培养时的取用量、配制日期等，置于冰箱中冷藏保存。•培养基中的其它成分如琼脂（7g/L)、蔗糖(3%)等无需配成母液，在培养基配制时直接加入。二、培养基的配制正确的培养基配制顺序（主要步骤）：•在烧杯中加入一定量的水→依次加入各类母液→加入蔗糖并充分溶解→定容