蛋白质组学

蛋白质组学蛋白质组（proteome）是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。一、蛋白质组学的概念蛋白质组学的概念及发展史►对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。►在不同细胞、不同组织中，同一基因组的表达情况各不相同。►在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组的含义蛋白质组学(proteomics)指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。主要研究内容►蛋白质组表达模式的研究：了解不同状态下细胞与组织的蛋白质组分的变化►蛋白质组功能模式的研究：明确各种蛋白质分子之间如何相互作用；二、蛋白质组学的产生与发展背景基因组时代→后基因组时代研究重点的转移结构基因组学→功能基因组学蛋白质组学是核心内容进展各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF），丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（HumanProteomeOrganization,HUPO）。美国国立癌症研究院（NCI）投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。►1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议►1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议►1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议►……►我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会。►2001年，中科院贺福初院士作为首席科学家，在全国范围内组织起一支研究队伍，提出了“人类重大疾病的蛋白质组学研究”973建议书并通过评审，并确立了9个相关课题组。2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。2013年9月7-10日，第八届中国蛋白质组学大会在重庆国际会议展览中心召开。本次大会的主题是“人类蛋白质组计划：让人类更健康”，并决定第九届中国蛋白质组学大会将于2015年在厦门召开。科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。目前，我国已在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展►2003年12月15日，国际人类蛋白质组计划(HPP)正式启动。首先开始执行人类血浆蛋白质组计划(HPPP)和人类肝脏蛋白质组计划(HLPP)两大先导项目。其中人类肝脏蛋白质组计划总部设在北京，由中国担当领导国，由中国科学家领衔组织。领衔专家是中科院院士贺福初教授。►两谱三图三库：“两谱”即人类肝脏蛋白质组的表达谱和修饰谱，“三图”是指人类肝脏蛋白质组的定位图、连锁图和结构图，“三库”即为人类肝脏蛋白质组的样本库、抗体库和数据库。2014年06月10日“中国人类蛋白质组计划（CNHPP）”全面启动实施。这是中国科学界乃至世界生命科学领域一件具有里程碑意义的大事。动物模型/细胞蛋白质组研究生物信息学分析功能分析人类疾病蛋白质组新技术蛋白质组研究的策略：平台与整合蛋白质组学研究技术蛋白质组研究的基本技术路线ProteolyticdigestionProteolyticfragmentsPureproteinElectrophoresisSampleMALDI-TOFCapillaryElectrophoresisHPLCN-AminoacidsequencingMassspectrumLC/MS/MSGCGDatabasesearching蛋白质组研究的支柱：双向电泳技术生物质谱生物信息学双向电泳技术1.双向电泳技术发展史（two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE）►O‘Farrell1975年创建高分辨率的双向凝胶电泳，对大肠杆菌细胞抽提物双向电泳，分离到1100个蛋白组分。但载体两性电解质使得pH不稳定且重复性差。►1982年Bjellqvist等引入固相pH梯度IPG（ImmobilizedpHgradients)。解决了双向电泳重复性差、阴极漂移、可比性差上样量低等一系列问题。►1994年，Rabilloud等用胶内水化的方法进行双向电泳，进一步增加了样品上样量。►1998年，Islam等IPGphor等电聚焦系统的引入大大简化了IPG－IEF，聚焦水化同时进行。2.双向凝胶电泳（2-DE）原理先根据蛋白质的等电点不同在pH梯度介质中进行第一次分离，即等电聚焦（isoelectricfocusing,IEF），然后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。完整的实验步骤包括：样品分离、等电聚焦、平衡、第二向分离、染色、成像、软件分析、蛋白质鉴定生物质谱（massspectrometry）技术►原理：样品离子化后，根据离子质荷比的不同进行分离并确定分子量，具有灵敏度高准确度高易于实现自动化等优点。►在80年代早期出现了两种新的离子化技术，使质谱从仅能分析小分子挥发物到可以研究生物大分子。*基质辅助激光解析离子化（MALDI）*电喷雾离子化（ESI）*2012年的化学诺贝尔奖这些技术能非常快速和准确的测定大分子物质，结合各种质谱技术后，可以在各种水平上研究蛋白质，为蛋白质的研究开辟新道路。质谱仪的分类飞行时间分析器四极杆分析器四极离子阱分析器离子回旋共振分析…….离子化的分了首先从加速电压获得预定量的动能，此动能为Uz，其中U指加速电压，z指电荷。由此可知离子的运动速度是v＝(2Uz/m)1/2，在U—定的情况下，由m/z决定其速度，这里m指离子分子的质量。换而言之，在同一距离中，低m/z的离子将比高m/z的离子运动得快。飞行时间分析器四极杆分析器由相对的两个电极组成一对组成，其中一对带有射频电压(RF)和直流电压(DC)，另一对杆有极性相反的电压。四极杆滤质器通过离子飞行的稳定性来选择特定质荷比的离子：通过变换RF幅度和DC电势，四极杆滤质器仅赋予特定m/z值的离子稳定的飞行轨道来通过滤质器并到达检测器，而其他m/z值离子则因为不具备稳定飞行轨道而被滤质器清除。四极离子阱分析器四极离子阱是由一对环形电极和两个呈双曲面形的端盖电极组成的，在环形电极上加射频电压或再加直流电压，上下两个端盖电极接地。离子阱的射频电场决定了离子在X、y轴方向的运动，而端盖电极决定了离子在Z轴方向的运动。通过电场的变换，离子按照m/z值递增的顺序从离子阱进入检测器，即利用离子飞行轨道的不稳定性来选择特定质荷比的离子。离子回旋共振分析离子在离子回旋共振分析仪中以某一特定的频率做回旋运动，并因此产生能被离子回旋共振分析仪的离子阱中检测板(电极)检测到的电流(镜像电流)。由于离子回旋频率与m/z是成反比的，被记录下来的信号时间间隔被转换为频率(傅立叶转换，PT)，最终计算得到m/z。►Singlequadrupole单四极杆►Triplequadrupole三级四极杆►Iontrap离子阱►TOF飞行时间►Orbitrap►FTICR►Q-TOF►TOF-TOF►Q-trap►Iontrap-TOF►LTQ-Orbitrap►LTQ-FT►…Builtoninnovations……ProvenbyourcustomersExceptionalcoverageHighsensitivityMSnFinniganLTQFTUltimatePerformanceRedefiningAccurateMassFinniganLTQOrbitrap生物信息学因特网上的数据库和工具NCBIUniProtSwiss-ProtKEGGReactome质谱数据库检索软件SequestMascot:Sonar,GutenTag,OLAV,ProbID,……定量蛋白质组学►定量蛋白质组学（QuantitativeProteomics）是对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行精确鉴定和定量。►定量蛋白质组学可用于筛选和寻找任何因素引起的样本之间的差异表达蛋白，结合生物信息学揭示细胞生理病理功能，同时也可对某些关键蛋白进行定性和定量分析。通常采用以下两种策略实现定量在蛋白水平的定量策略：将蛋白复合物进行二维凝胶电泳，比较蛋白在凝胶上染色的深度进行相对定量，再对差异蛋白进行质谱分析定性。在肽段水平上的定量策略：此类方法通常需引入一种稳定同位素(13C、3H或5N)标记的基团．不向的蛋白混合物被酶(如胰酶)水解成肽段，来源于其中一种蛋白混合物的肽段被轻同位素(12C、2H或4N)基团标记，而另一来源的肽段被重同位素基团标记，通过同位素区分肽段在质谱中所形成的峰高和面积或者报告离子的峰高和面积，对不同样品间的相同蛋白质进行定量。按定量方式相对定量绝对定量按标记方法标记法•体内标记法（SILAC）•体外标记法(ICAT、ITRAQ、AQUA、18O)无标记法•信号强度法•谱图计数法SILAC原理流程ICAT原理无标签标记蛋白质组学各种定量方法的比较►鉴定蛋白质的方法质量纹鉴定法（PeptideMassFingerprinting）二级质谱的数据库搜索鉴定法（MS/MSDatabaseSearching）蛋白质的鉴定方法多肽质量纹鉴定►多肽质量纹（PeptideMassFingerprinting，PMF）是从一级质谱（MS）中鉴定多肽的主要方法。►多肽质量纹一般都是在MALDI-TOF仪器的结果上进行。►其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的信息。一级质谱图►蛋白质经过酶解后，送入质谱仪，得到一级质谱。►目前来说，由MALDI-TOF质谱仪产生的质谱图精度较高，而由ESI质谱仪产生的质谱图精度相对较低。►另一个问题是，ESI产生的质谱图中的离子通常带有很多电荷，而MALDI质谱图中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算。►所以从一级质谱鉴定蛋白质的算法（质量纹）主要用在MALDI-TOF产生的质谱图上。SampleMSSpectrum蛋白序列数据库►在美国国家生物信息中心的网站上可以查询到最新的蛋白序列数据库。►NCBI上的数据库中，信息最丰富的是Genpept格式，包括有蛋白的序列，各种性质，甚至于参考文献。►蛋白序列的信息。Genpept示例Genpept示例FASTA格式►FASTA格式就是蛋白的氨基酸序列。虚拟酶解►对应于送进质谱仪的样品，我们可以对数据库里的序列作一次虚拟的酶解。质量排列►虚拟酶解的结果，产生了一系列的多肽，我们可以计算每个多肽的质量。►最后一个R的质量多加了18，这是因为我们写在下面的是残基的分子量。质量排列的►把所有多肽的质量排序。质量纹►如此，质谱图上的质量就可以与多肽上的质量相匹配。质量纹►这就是多肽质量纹（PMF）的最基础的思路。►目前常用的质量纹算法Mascot:Profound:Expasytools: