鸡β-防御素-1重组毕赤酵母的制备与表达

鸡β-防御素-1重组毕赤酵母的制备与表达姓名：庄杰导师：张兴群概述β-防御素是鸡体内的一种重要抗菌肽，除了具有直接的杀菌、抗病毒作用外，它还参与机体免疫反应，如今由于抗生素的滥用引发的问题而日益引起人们广泛关注。动物防御素具有代替传统抗生素的潜力，主要表现在：抗菌谱广，免疫原性无或低，对人畜无毒副作用，无残留，无耐药性，热稳定性和溶解性良好，对较高离子强度或较大pH变化耐受性较好。因此，防御素越来越受到研究人员的关注。防御素防御素是一类碱性阳离子抗菌肽，相对分子质量为3500-4500左右，分子中含有6-8个保守的半胱氨酸残基，形成3-4对分子内二硫键，并通过半胱氨酸分子间二硫键使肽环形成反向平行的β-片状结构。根据其分子内半胱氨酸的位置和连接方式及前体性质的差异可分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆虫防御素和植物防御素。防御素具有广谱抗微生物作用，包括各种细菌、真菌和一些具膜病毒，为机体抵御外界微生物侵袭的第一道屏障。抗菌机理防御素种类多种多样，抗菌谱也各不相同。不同的防御素的作用方式可能不同，同一种防御素与不同微生物作用时机理也可能不同。防御素的杀菌机理主要有以下几种：1.破坏细胞膜，形成离子通道防御素可以通过电荷间的相互作用与细胞膜外层结构结合，其疏水部分在疏水作用和分子张力作用下，能够改变细胞膜的流动性和厚度，从而使细胞膜上出现孔洞，导致细胞质外渗或细胞外的物质进入到细胞内，严重时会引起细胞膜崩解，导致细胞死亡。抗菌机理2.抑制胞外大分子的合成防御素对肽聚糖、几丁质及一些生物大分子合成、交联的抑制也可能是其重要的杀菌机理之一。3.抑制胞内功能防御素也能够破坏某些重要的胞内过程，从而促进细胞死亡。在某些实验中发现微生物能够在膜不完整的情况下存活更长的时间，这就预示着防御素可能有非膜破坏杀菌机制的存在。抗病毒机理防御素抑制和杀伤肿瘤细胞的机制与杀菌的机制不尽相同，它比杀菌机制更为复杂。一方面，它能通过其细胞毒性，主要是对细胞膜、核膜、线粒体、细胞核染色体和细胞骨架等的损伤来达到杀伤肿瘤细胞的效果；另一方面，防御素能通过调动机体免疫机能，从体液免疫方面来抵抗癌细胞的入侵。防御素的应用现状1在医药行业的应用细菌对传统抗生素的耐药性是当今全球性难题，防御素因其具有广谱的抗菌活性，独特的抗菌机理，并与典型的抗生素具有协同作用，能中和内毒素，调节机体免疫应答和炎症反应，调节组织创伤修复等特点引起了人们的广泛关注2在食品行业的应用在食品方面，防御素主要用作防腐剂，防止食品腐败变质。防御素的应用现状3在农业上的应用防御素在农业中可用于农作物抗病育种。4在畜牧业上应用防御素作为饲料添加剂对细菌具有很强的抑制作用，能够促经畜禽生长，提高饲料的利用率，动物在采食以后不会再体内残留。酵母表达系统酵母是目前研究比较成熟的一种表达系统，研究表明，防御素在酿酒酵母中的表达水平较低，而选用毕赤酵母则可获得高效表达，其表达水平高达70mg/L，且重组肽具有与天然肽相似的二级结构和生物活性。酵母表达系统作为外源蛋白表达系统，毕赤酵母有其独特的优势：遗传操作简单；对重组蛋白可以进行翻译后加工修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；具有强有力的乙醇氧化酶(AOXI)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；对需氧生长有强的偏好，这一生理学特性使它能高密度发酵生长，表达量高，对工业放大生产有利；毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分离和纯化。防御素毕赤酵母的构建及筛选利用TRNzol试剂盒从安徽三黄鸡肝脏中抽提总RNA，并进行电泳检测；根据Genbank中登录的鸡β-防御素-1基因序列，设计一对特异性引物，利用设计的引物扩增Gal-1成熟肽基因片段；将此片段与pMD-18-T载体相连，构建重组克隆载体pMD-18-Gal-1，转化大肠杆菌DH5α后进行鉴定、序列测定；后将测序正确的目的片段与载体pPIC3.5K连接，构建重组表达质粒pPIC3.5K-Gal-1，单酶切后用电转化的方法将构建的重组表达载体整合入毕赤酵母GS115中，然后进行了高拷贝的筛选和表型的鉴定。高拷贝筛选一般情况下，整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多，蛋白表达量就越高。pPIC3.5K含有neo基因，赋予毕赤酵母G418抗性。而G418抗性水平主要依赖整合的neo基因的数目。单拷贝pPIC3.5K整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约0.25mg/mL的G418抗性水平。因此可以通过G418抗性水平初步推断该克隆所包含的拷贝数。高拷贝筛选实验中使用浓度分别为0，50，100，200，300μg/mL的G418来进行高拷贝的初步筛选，然后进一步通过实时定量PCR来验证，两者结果基本一致。但也有研究发现高拷贝与高表达并不一定对应。因此，基因拷贝数对表达量的影响还无法预测，高表达菌株的筛选只应以表达蛋白量的高低作为唯一标准。因此还需要进行下一步的表达工作来证明高拷贝是否能提高重组Gal-1的表达量。转化子表型的鉴定外源蛋白在酵母基因组中的整合方式有两种：一种是在His4或5’AOX1启动子区域，酵母染色体上的AOX1基因保持完整，这种整合产生的菌株表型为Mut+；另一种是双位点置换，含5’AOX1启动子、外源基因和转录终止区的表达单元将染色体上的AOX1基因置换下来，导致AOX1基因的缺失，因而只能依靠弱转录的AOX2基因，所以利用甲醇速度慢，由此产生的菌株表型为Muts。转化子表型的鉴定基于此原理，我们对转化子进行了表型鉴定，方法是以5’AOX1/3’AOX1作为引物，酵母基因组作为模板进行PCR扩增。如果是Mut+整合，可见两条带，一条与目的基因相关，另一条为AOX1基因（大小约为2.2kb），如果是Muts整合，只有与目的基因相关的一条带。重组酵母菌表达培养基：需要BMGY/BMMY(缓冲复合甘油或缓冲复合甲醇培养基)BMG/BMM(缓冲最小甘油或缓冲最小甲醇培养基)MGY/MM(最小甘油或最小甲醇培养基)进行表达。BMG,BMM,BMGY,BMMY用于分泌蛋白表达，特别是当PH对蛋白活性比较重要时。它们是缓冲培养基，这与MGY、MM不同。这四种培养基用磷酸盐缓冲，PH值在一个较大的范围内，可用于蛋白优化表达。酵母浸出物及蛋白胨作为“混合饲料”，使生长更好并可积累大量表达产物。重组酵母菌表达蛋白酶：有些蛋白特别易受在中性PH值时有很好活性的蛋白酶的影响。在这种情况下，建议用MGY，MM培养基，因为当毕赤酵母在无缓冲培养基如MM中表达时，PH降至3或更低，许多中性PH蛋白酶都将失活。毕赤酵母对低PH值有抗性，因此低PH值不会影响生长。如果表达蛋白降解了，尝试在无缓冲培养基中进行表达。如果以上条件仍不能有效防止蛋白降解，可将基因转入SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，转化与表达程序与GS115相同，也可用于大规模发酵。重组酵母菌表达换气：毕赤酵母高效表达的重要因素是在甲醇诱导时充分换气。基本上在诱导时，培养基不要超过摇瓶体积的10-30%。建议使用隔板摇瓶，用2-3层干酪包布或松散合适的盖子盖住摇瓶，不要用很紧的盖子。(换气在诱导前大量培养时并不那么重要)温度及振荡：所有表达需在30度的摇床中进行。温度不能超过30度很重要，如果摇床温度不稳，设置在28度。使用落地式摇床，速度为225-250rpm，如果为台式摇床，速度调至250-300rpm。重组酵母菌表达开始前：先证实重组子及对照重组子(无插入，1拷贝插入)在GS115中的表达情况。进行表达时，选择合适的对照很重要，可以更好地解释你的表达结果。表达对照如下：GS115/HIS+Mut+β-galMut+胞内表达对照GS115/HIS+MutsAbluminMuts分泌表达对照GS115/载体(无插入)背景对照GS115/载体(1拷贝插入)单拷贝基因表达水平对照不同的重组形式均会影响表达，建议挑取6-10个克隆进行表达水平筛选。重组酵母菌表达Mut+胞内表达：为检测表达条件是否有效，可培养GS115β-gal(Mut+)(胞内表达-半乳糖苷酶)。亲代载体转化GS115作为胞内表达背景对照。1挑取单克隆，接种至25mlMGY，BMG或BMGY中，(250ml摇瓶)，28-30度，250-300rpm摇至OD600=2-6(对数生长，大约16-18小时)2室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用MM，BMM或BMMY重悬细胞至OD600=1.0，进行诱导表达(大约100-200ml)3在1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入摇床继续生长。重组酵母菌表达4每24小时，加甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。检查培养基的量，确保正确加入甲醇，因为蒸发作用会减少培养基的体积。5在下列的各个时间点，取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。6用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，westernblot或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达(SDS-PAGEp47)。重组酵母菌表达Muts胞内表达:可培养GS115Ablumin(Muts，分泌白蛋白至培养基中)检测培养条件的效率。记住要用转化亲本载体的GS115作为胞内表达的背景对照。1挑取单克隆，接种至含100mlMGY，BMG或BMGY的1L隔板摇瓶中。在摇床中28-30度，250-300rpm生长至OD600=2-6(约16-18小时)2室温1500-3000g离心5min收集细胞，去除上清，用1/5-1/10原培养基体积的MM，BMM或BMMY重悬细胞(约10-20ml)3置于100ml隔板摇瓶中，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住瓶口，放入摇床继续培养。重组酵母菌表达4每隔24小时，加入甲醇至终浓度为0.5%以继续诱导。5在下列的各个时间点，取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2-3min。时间点：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。6用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，westernblot或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达。重组酵母菌表达SDS-PAGE分析：任何标准SDS-PAGE仪器及程序均可用，如12%聚丙烯酰胺凝胶，5%浓缩胶用于分离40-100kDa蛋白。样品准备：需要准备Breaking缓冲液(P60)及酸洗0.5mm玻璃珠细胞洗涤准备：(胞内或分泌表达)1快速融化细胞沉淀，置于冰上2每1ml样品，加入100ul裂解缓冲液(细胞+上清)3加入等量的酸洗玻璃珠(0.5mm)，通过置换来估算相等体积重组酵母菌表达4涡旋30s，冰上孵育30s，重复8次54度最大转速离心10min，将上清转移至干净的微量离心管中6取50ul上清(细胞裂解物)，，加入50ul2×SDS-PAGE凝胶上样缓冲液(样品buffer)7煮沸10min,每孔加10-20ul，依胶的厚薄及孔量，决定点样量。剩下样品存于-20度，用于westernblot。细胞裂解物存于-80度用于分析。重组酵母菌表达如果没有表达或表达极低：1可以进行northernblot分析或检查基因转录情况。2PCR分析插入情况。PCR选取12-20个转化子才可信，用空载体及单拷贝插入载体作对照分析PCR结果3如果有转录提前终止，检测基因的AT结构，改变使转录提前终止的基因序列，才能出现更长的转录。细胞裂解提取产物细胞裂解程序：准备breakingbuffer（BB）1用BB重悬清洗细胞，4度下3000g离心5-10min，2用BB重悬细胞至OD600＝50-1003加入等体积的酸洗玻璃珠（0.5mm），通过替代预测体积4涡旋混合物30s，冰上孵育30s，