鼻咽癌患者血浆EBVDNA﹑血清CYFRA21-1和VCA-IgA的检测及临床应用

ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ鼻咽癌患者血浆EBVDNA﹑血清CYFRA21-1和VCA-IgA的检测及临床应用孙剑光1王化修2肖方庚1刘亚林1（1邵阳医学高等专科学校附属医院耳鼻喉科；2邵阳医学高等专科学校病理教研室；湖南邵阳422000）摘要目的探讨血浆EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA三种肿瘤标记物对鼻咽癌诊断、疗效监测和预后判断的临床应用价值。方法分别采用荧光定量PCR法、电化学发光法和免疫酶法检测62例鼻咽癌患者治疗前、后及62例健康对照者血浆EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA含量，并进行对比分析。结果治疗前组血浆EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA的阳性率明显高于健康对照组（P＜0.01）；治疗后组血浆EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA含量高者，在随访中发现肿瘤残存、复发或远处转移。结论血浆EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA的检测对鼻咽癌的早期诊断与高危人群的筛查、以及对鼻咽癌患者的疗效监测和预后判断有重要的临床应用价值，三种肿瘤标记物的联合检测有互补作用。[关键词]鼻咽癌；EB病毒；EBVDNA；CYFRA21-1；VCA-IgAQuantificationandClinicalApplicationofPlasmaCell-freeEBVDNA,CerumCYFRA21-1andVCA-IgAinPatientswithNasopharyngealCarcinomaSUNJian-guang1,WANGHua-xiu2,XIAOFang-geng1,LIUYa-lin1(1.DepartmentofOtolaryngology,theAffilicatedHospitalofShaoyangMedicalCollege;2.DepartmentofPathology,ShaoyangMedicalCollege,Shaoyang,Hunan422000)Abstract:【Objective】ToinvestigatetheroleofplasmaEBVDNA,serumCYFRA21-1andVCA-IgAindiagnosis,curativeeffectsurveyandprognosisofnasopharyngealcarcinomapatients(NPC).【Methods】TheplasmaEBVDNA,serumCYFRA21-1andVCA-IgAin62nasopharyngealcarcinomapatientsand62healthycontrolswereanalyzedusingfluorescencequantitativepolymerasechainreaction,electrochemiluminescenceimmunoassay,andimmunoenzymeassay,respectively.【Results】ThepositiveratesandconcentrationsofplasmaEBVDNA,serumCYFRA21-1andVCA-IgAamongnewcaseswithNPCweresignificantlyhigherthanthoseamonghealthycontrols(P0.01).Afterthecompletionoftreatment,thepatientshadsignificantlyhigherplasmaEBVDNAandserumVCA-IgAconcentrationcomparedwithpatientswhohadnot,theresidualtumors,locoregionalrecurrenceanddistantmetastasis.【Conclusion】plasmaEBVDNA,serumCYFRA21-1andVCA-IgAdetectinhaveimportantvalueinearlydiagnosis,screeningofhighriskpopulation,curativeeffectsurveyandprognosis.Thesimultaneouscombinationtestscanriseadvantagetoeachother.【基金项目】：邵阳市科技计划项目（Z09004）【作者简介】：孙剑光（1963-），男，副教授，研究方向：头颈部肿瘤防治。ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅKeywords:nasopharyngealcarcinoma;Epstein-BarrVirus;EBVDNA;CYFRA21-1;VCA-IgA鼻咽癌（nasopharyngealcarcinomaNPC）是耳鼻喉科最常见的恶性肿瘤之一，病理位置隐匿，早期临床表现不明显，易被患者忽视，多数患者在发现颈部淋巴结肿大才来就诊，此时已转移。临床上诊断鼻咽癌主要依靠影像学及鼻咽局部检查加细胞涂片或病理活检，早期诊断有一定困难。放疗是治疗鼻咽癌的主要方法，虽然随着放疗设备和技术的改进、综合治疗的广泛应用，鼻咽癌的疗效有了明显提高，但治疗后仍有约30%-40%的患者因复发或转移导致治疗失败[1]。复发与转移是鼻咽癌患者死亡的主要原因[2]，目前尚无监测鼻咽癌患者治疗效果的有效方法。本研究通过血浆EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA的检测，来探讨这三种肿瘤标记物对鼻咽癌早期诊断、疗效监测和预后判断的临床应用价值。1资料与方法1.1研究对象选择2008年1月至2008年12月，初诊在我院耳鼻喉科病理确诊，接受根治性放疗后又来我科跟踪随访的鼻咽癌患者62例，其中男43例，女19例，年龄26-68岁，中位年龄48岁。放疗后每3个月随访一次，随访截止时间为2009年6月，中位随访时间为6（1-15）个月。随访时对患者进行常规体检及间接鼻咽镜检查，对可疑肿瘤残存或局部复发者行纤维鼻咽镜活检，可疑远处转移者加用其他检查手段。再随机选取健康体检人员62例作为对照。1.2标本采集分别抽取治疗前（初诊）、治疗后（2-6W）鼻咽癌患者及健康对照组人员的清晨空腹肘静脉血10ml，其中5ml放入普通试管中，另外5ml放入EDTA抗凝管中，离心分离得血清和血浆，置于-20℃冻存。1.3样本DNA抽提与荧光定量PCR反应冻存的血浆置于4℃解冻，每例标本取50ul血浆，用QIAamp血液DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）抽提DNA。抽提方法按试剂盒说明书进行。荧光定量PCR反应测定血浆EBVDNA水平。EB病毒核酸扩增荧光检测试剂盒购买自中山大学达安基因股份有限公司，包括DNA提取液、临界阳性质控品、强阳性质控品、阳性标准品、阴性质控品以及PCR反应管等。用上海枫林FTC-2000实时荧ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ光定量PCR仪进行检测，检测步骤、结果判断以及质量控制方法按厂家说明。1.4电化学发光法检测血清CYFRA21-1含量采用电化学发光法检测血清CYFRA21-1含量。仪器Elecsys1010全自动电化学发光免疫分析仪，瑞士Roche公司产品，试剂盒由Roche公司提供。操作过程严格按说明书进行。1.5免疫酶法检测血清VCA-IgA滴度用常规的免疫酶法检测血清VCA-IgA滴度。1.6阳性判断标准血浆EBVDNA＞0copies/ml为阳性；血清CYFRA21-1＞3.3ug/L为阳性；血清VCA-IgA滴度≥1：10为阳性。1.7统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计分析，数据用（_x±S）或中位数表示，样本比较用u检验。2结果2.1血浆EBVDNA水平治疗前组EBVDNA阳性率为95.16﹪（59/62），中位拷贝数为94×104copies/ml。治疗后组EBVDNA阳性率为30.65﹪（19/62），中位拷贝数为0copies/ml；在19例EBVDNA阳性患者中，有15例处于高拷贝状态，在随访过程中发现9例肿瘤残存或局部复发，6例发生远处转移。另外，有2例EBVDNA阴性患者在随访过程中出现远处转移。健康对照组EBVDNA阳性率为6.45﹪（4/62），中位拷贝数为0copies/ml。治疗前组EBVDNA阳性率显著高于健康对照组（u检验：u=9.87，P＜0.01，差异有高度显著性）。血浆EBVDNA检测结果见表1。表1血浆EBVDNA水平组别例数阳性人数（例）阳性率（﹪）中位拷贝数（copies/ml）治疗前组625995.1694×104治疗后组621930.650健康对照组6246.4502.2血清CYFRA21-1含量治疗前组CYFRA21-1阳性率为58.06﹪（36/62），含量为6.83±5.21ug/L。ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ治疗后组阳性率为14.52﹪（9/64），含量为1.62±0.46ug/L，9例阳性病人在随访过程中有4例为肿瘤残存或局部复发，有5例为远处转移，其中有2例EBVDNA阴性。健康对照组阳性率为0，含量为1.32±0.23ug/L。治疗前组CYFRA21-1阳性率显著高于健康对照组（u检验：u=7.12，P＜0.01，差异有高度显著性）。血清CYFRA21-1含量见表2。表2血清CYFRA21-1含量组别例数阳性人数（例）阳性率（﹪）CYFRA21-1浓度(_x±S，ug/L)治疗前组623658.066.83±5.21治疗后组62914.521.62±0.46健康对照组62001.32±0.232.3血清VCA-IgA滴度治疗前组VCA-IgA阳性率为93.55﹪（58/62），治疗后组阳性率为74.19﹪（46/62），健康对照组阳性率为35.48﹪（22/62）。治疗前组VCA-IgA阳性率显著高于健康对照组（u检验：u=6.67，P＜0.01，差异有高度显著性）。血清VCA-IgA阳性率比较见表3；滴度比较见表4。表3血清VCA-IgA阳性率比较组别例数阳性人数（例）阳性率（﹪）治疗前组625893.55治疗后组624674.19健康对照组622235.48表4血清VCA-IgA滴度比较滴度分级治疗前组（例）治疗后组（例）健康对照组（例）阴性＜1：1041640低滴度1：10-1：20113119中滴度1：40-1:160高滴度＞1:1603710963062例初诊鼻咽癌患者血清VCA-IgA滴度除4例阴性11例处于低滴度外，余ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ47例均≥1：40；治疗后组中肿瘤残存或局部复发或远处转移者除2例VCA-IgA处于低滴度外，有15例处于中高滴度状态；健康对照组除3例处于中高滴度状态外，余均≤1：20。3讨论鼻咽癌在我国华南地区相对高发，与EB病毒密切相关。在鼻咽癌的发展过程中，EB病毒感染和多种体细胞遗传和表观遗传变化协同地破坏正常细胞功能，引起鼻咽癌的发生[3]。鼻咽癌具有特殊的临床病理特征，包括对放疗异常敏感，容易出现肿瘤残存、局部复发和远处转移。目前鼻咽癌患者疗效的监测主要依据鼻咽镜和影像学检查，但对放疗后肿瘤侵润与纤维化的鉴别、残存肿瘤性质的判断以及较小转移灶的诊断等方面具有一定的局限性[1]。因此，探索能监测鼻咽癌患者疗效的相关肿瘤标记物显得十分必要。肿瘤标记物是指标示肿瘤存在的一些生物化学物质，从临床应用角度出发，它们主要指那些在血浆或其他体液中可以检测到的有关物质[4]。近年来，有研究者在肿瘤患者血浆和血清中发现肿瘤源性DNA存在[5]，血浆中的肿瘤源性DNA可能是肿瘤细胞死亡的标志[6]。Lo等[7]首次报道应用荧光定量PCR技术在96﹪的鼻咽癌患者和7﹪的正常对照者血浆中检测到EBVDNA，同时发现鼻咽癌患者血浆EBVDNA平均拷贝数明显高于正常对照阳性者，得出鼻咽癌患者血浆EBVDNA平均拷贝数与患者病情有一定相关性的初步结论。本研究应用荧光定量PCR技术分析鼻咽癌患者治疗前与治疗后血浆EBVDNA含量，并结合临床检查和相关影像学检查跟踪随访患者预后情况，发现治疗后组19例EBVDNA阳