目的基因的原核诱导表达及SDS-PAGE凝胶电泳

目的基因的原核诱导表达及SDS-PAGE凝胶电泳现代分子生物学大实验实验目的•重点掌握表达载体构建的原理及方法•掌握目的基因原核诱导表达的原理及方法•了解目的蛋白质“标签”纯化的基本原理和方法•掌握PAGE变性凝胶电泳的原理及方法•掌握考马斯亮蓝染色的方法•目的蛋白质的诱导表达•目的蛋白质的纯化•目的蛋白质的检测实验原理•蛋白质的表达：将克隆基因插入合适载体后导入宿主细胞表达大量蛋白质的方法。•体内很难分析单个蛋白质的作用•进行大量表达和纯化是为了在体外进行研究•应用于蛋白纯化、定位及功能分析等方面实验原理图pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16peptides融合蛋白在Hela细胞中的荧光显微镜检测（×400）例•酵母表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统•表达的蛋白具有正常的活性、构象•技术难度较大、耗时、耗资•大肠杆菌表达系统•实验技术简单，时间较短，费用低，系统比较完备•不能有效地对重组蛋白质进行修饰加工，易形成包涵体原核细胞表达系统真核细胞表达系统实验原理•原核细胞表达系统菌株–菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。–堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。–大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。实验原理•原核表达质粒的构建–目的基因–表达载体PlasmidTaglacIqPromoterAmpr多克隆位点实验原理•目的基因/DNA/PCR/酶切/Primer•例：•p38中抑制多肽16肽序列–GGAAGAACATTGTTTCCTGGTACAGACCATATTGATCAGTTGAAGCTC•F5’-ACGGATCCTAGGAAGAACATTGTTTCCTGGT-3’•R5’-ACGGATCCTTAGAGCTTCAACTGATCAATATGG-3’•5’端引物中AC是随机保护碱基，GGATCC是BamHI酶切位点，TA是为防止移码而引入的两个碱基，随后是编码16肽前7个氨基酸的碱基序列。•3’端引物中AC是随机保护碱基，GGATCC是BamHI酶切位点，TAA是终止密码子的反向互补序列，随后是从编码16肽碱基序列的最后一个碱基开始的反向互补序列。实验原理•表达载体–能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中;在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。•元件–启动子、终止子、核糖体识别序列–诱导性表达所需要的元件•操纵子序列•调控基因–多克隆位点–融合Tag–复制起始序列–筛选标记/报告基因•各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。实验原理•启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子，•转录终止子•核糖体结合位点启动子、终止子、核糖体识别序列操纵子序列及配套的调控基因•诱导性表达所需要的元件多克隆位点复制起始序列实验原理•用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag）。•标签位于表达载体的多克隆位点的N端或者C端，能够与目的基因融合表达（N端或者C端融合表达）。•目前常用的标签有–组氨酸标签（His-Tag）–谷胱甘肽S转移酶（glutathioneStransferase）标签（GST-Tag）–硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）标签–麦芽糖结合蛋白（MaltoseBindingProtein,MBP）–蛋白质A（proteinA）–纤维素结合位点（cellulosebindingdomain）标签等。•一般对于小分子用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag（如His）减少对目的蛋白的影响。实验原理•筛选标记/报告基因表达•抗药性基因，Amp是最常见的筛选标记，kana，新霉素，四环素，红霉素和氯霉素。•抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。•GFP（绿色荧光蛋白）是最常用的报告基因了，半乳糖苷酶，荧光素酶。•一些融合表达Tag也有报告基因的功能。实验原理•常用表达载体–pGEX系列载体是谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白表达系统的载体。•PtacPromoter•Amp•pGEX-KG–pET系列的载体是His6融合蛋白的表达载体。•T7•Kana•pET-14b实验原理•目的蛋白质的诱导表达–lacIq（Lactose）–lacI是大肠杆菌中lac操纵子（Operon）的调节基因，它所表达的阻遏蛋白是lac操纵基因（Operator）的抑制因子，抑制转录启动。–当有乳糖存在时，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使lac操纵子上的结构基因lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙酰基转移酶）得以正常表达，启动转录。–IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)作为乳糖的类似物与lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，因此IPTG经常作为lac操纵子的诱导剂而使用。实验原理AmpRPlasmidpGEX-KGGSTlacIqPtacPromoterAmprIPTG多克隆位点实验原理BamHINdeIBamHIcDNA酶切NdeI基因片段酶切后的目的基因酶切连接转化筛选（蓝白斑）鉴定（PCR、酶切、测序）原核表达质粒的构建成功•原核表达的诱导条件–IPTG浓度：0.01-5mmol/L–诱导时间：～3h–诱导温度：15-42℃实验原理•目的蛋白质的纯化–破碎细胞•超声破碎•溶菌酶裂解–从细胞蛋白中纯化出GST和His融合蛋白•GST可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。由于GST对谷胱甘肽的亲和力非常高，因此可以利用谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白进行纯化，最后通过含有游离的谷胱甘肽的缓冲液,洗脱结合的GST融合蛋白。•PolyHis多聚组氨酸能与多种过渡金属或过渡金属鳌和物结合，因此带HIS-6的蛋白能结合与固化的Ni2+树脂，用适当的缓冲液（PBS）洗冲洗去除其他杂蛋白后，再用可溶的竞争性鳌合剂（咪唑）洗脱可以回收靶蛋白。实验原理•目的蛋白质的检测–蛋白质分子量的检测–SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳–目的蛋白质的分析实验原理•十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法。•SDS是一种强阴离子型去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，强还原剂例如β巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，通过加热使蛋白质解离。解离后的氨基酸侧链与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。实验原理蛋白质中加入SDS并加热，SDS分子上的非极性区(黄色尾巴)会与蛋白质上的非极性区结合，使蛋白质变性，成为一线状长条分子，上面布满SDS分子。SDS分子的极性区(洋红色圆点)，则露在外面，以增加亲水性。SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白质分子间的天然的电荷差异。SDS最终使蛋白质变成具有高负电荷的线状分子。97.0kDa实验准备•诱导、培养–37℃恒温摇床•电泳检测–HoeferminiVEVerticalElectrophoresisSystem仪器与设备•LB培养基、Amp、IPTG•30%丙烯酰胺贮液•1.0MTris(PH6.8)(浓缩胶),1.5MTris(PH8.8)(分离胶)•10%SDS，10%过硫酸铵（AP），四甲基乙二铵（TEMED）•1XTris-甘氨酸电泳缓冲液：25mMTris,250mM甘氨酸，0.1%SDS•1xSDS上样缓冲液：50mMTris-HCl（6.8），100mMDTT，2%SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝•染色液：90甲醇：90冰乙酸：20水＋0.5gR-250•脱色液：90甲醇：90冰乙酸：20水实验试剂实验步骤•培养•诱导•样品制备•SDS-PAGE•凝胶检测实验步骤1）挑取单菌落，接入3ml含氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养液，37℃培养过夜。2）取50ul过夜培养物接入3ml含氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数中期（A600=0.5~0.6）。3）吸出500ul未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，室温高速离心1min，沉淀悬浮于100ul1xSDS凝胶加样缓冲液，100度加热3min，室温高速离心1min，冰上放置。4）在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续培养3h，取500ul样品放于微量离心管中，室温高速离心1min。5）沉淀悬浮于100ul1xSDS凝胶加样缓冲液，100度加热3min，室温高速离心1min，冰上放置，待全部样品处理完后上样。目的蛋白质的诱导表达及检测6）将电泳槽玻璃板洗净，吹干，并用凡士林封边,安装好7）配12%分离胶，将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶槽高三分之二处，加蒸馏水密封。待胶凝固后（约需30min倒掉水，用吸水纸吸干8）配5%浓缩胶将配好的浓缩胶立即倒入凝胶槽内（以插入梳子不溢出为宜），插入梳子9）待胶凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中10）制备好的样品加入上样孔11）连接电泳仪12）打开电源，调整电压至80V，待样品跑过浓缩胶（大约需30min）后将电压调至120V，待指示剂（溴酚兰）到达凝胶的底部距离下缘1cm时停止电泳，大约需2h，电泳结束。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶配制（miniVE）12％分离胶5%浓缩胶H2O2.45ml2.05ml30%丙稀酰胺3.0ml0.5mlTris缓冲液1.9ml（1.5MpH8.8）375ul（1.0MpH6.8）10%SDS75ul30ul10%过硫酸铵75ul30ulTEMED3ul3ul注：1.丙稀酰胺为神经毒剂，使用时要小心，操作请务必戴手套。2.过硫酸铵需新鲜配制，并注意浓度，否则影响胶凝固。3.1块胶可以用10ml离心管，2块胶要使用小三角瓶便于混匀，配制后余液可暂时留存，便于参考胶凝固时间，一般30min即可。目的蛋白质的检测-考马斯亮蓝染色•考马斯亮蓝R250（coomassiebrilliantblue）是一种三苯甲烷纺织染料，又称酸蓝83，分子上含有两个S03H基团，偏酸性，能结合在蛋白质的碱性基团上。•能够检测出大于0.1ug蛋白条带。•将凝胶浸泡在染色液中，室温在摇床上缓慢染色4小时（或过夜）。•脱染：将染液回收，凝胶先用蒸馏水漂洗一次，浸入脱染液中脱染，室温浸泡凝胶或37℃加热使其脱色，更换几次脱色液，直至出现清晰的电泳带为止。•脱色后，将凝胶保存在水中或是20%甘油的水中。凝胶染色作业•按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验材料、实验用品及药品、实验步骤、实验结果。•阐述目的基因表达载体的构建。•分析实验结果。•包涵体的出现是目的基因的原核表达中常见问题，其发生原因是什么，如何解决？实验结果与分析Thankyouforyourattention!