高效液相色谱的使用及氨基酸标样的分析

高效液相色谱的使用及氨基酸标样的分析高效液相色谱的使用及氨基酸标样的分析一、高效液相色谱的基础知识二、LC-10AVP液相色谱仪键盘操作三、氨基酸标样的分析一、高效液相色谱的基础知识高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）以前也称为高压（highpressure）液相色谱法、高速（highspeed）液相色谱法。HPLC是在经典的液相色谱法的基础上，在20世纪70年代后快速发展起来的一项高效、快速的分离分析技术。它是以经典的液相色谱为基础，以高压下的液体为流动相的色谱过程，具有高压、高效、高速和高灵敏度的特点。广泛应用于医药、生化、石油、化工、环境卫生和食品等领域。液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用•气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力一、色谱的起源石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱二、定义色谱法：利用组分在两相之间分配系数不同而进行分离的技术移动相：携带样品流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相，通常为色谱柱固定液反相液相色谱流动相极性大于固定相极性能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物正相液相色谱流动相极性小于固定相极性不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC三、流动相的选择•采用“HPLC”级溶剂•避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂•对试样有适宜的溶解度•溶剂粘度要小•与检测器相匹配四、高效液相色谱仪的基本结构高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成，其基本结构如下图：高效液相色谱的特点与基本结构.ppt二、LC-10AVP液相色谱仪键盘操作三、氨基酸标样的分析一、实验目的（1）熟悉高效液相色谱仪的结构、分离原理和操作程序。（2）掌握氨基酸标样的分析方法、原理。二、实验原理氨基酸与PITC发生反应生成的衍生物，在254nm处有最大吸光值。氨基酸衍生物进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积可进行定性和定量。该方法是柱前衍生法中的一种。PITC方法的反应方程式如下图所示：PITCPTC•三、实验仪器和试剂1、仪器：高效液相色谱仪（带紫外检测器）。2、材料氨基酸标样3、试剂：衍生液：异硫氰酸苯：甲醇：三乙胺：水（V/V）=1：7：1：1正己烷、乙腈、乙酸、乙酸钠以上试剂中乙腈为色谱醇，水为二次蒸馏水，其它为分析醇。四、实验步骤1、柱前衍生步骤：（1）将200ul衍生液加入200ul氨基酸标样或样品中，震荡使混合均匀，室温放置1小时。（2）反应液中加入400ul正己烷，充分震荡后放置使分层。（3）取下层溶液用一次性滤膜过滤器（0.45ul）过滤。（4）取滤液5ul注入HPLC。2、分离条件的设定（1）色谱柱：Shim-packVP-ODS4.6mmx15cm•保护柱：Shim-packGVP-ODS4.6mmx1cm（2）流动相：•A液：0.1M乙酸钠pH6.50（用乙酸调整，500ml乙酸钠中约加2滴乙酸）。•B液：乙腈/水=4/1（3）流量：1ml/min•柱温：36℃•检测波长：254nm（4）梯度洗脱程序：•TIME(min)FUNCVALUE•0．01BCONC10•3BCONC10•21BCONC39•21.01BCONC80•25BCONC80•25.01BCONC10•35STOPSTOP3、数据采集打开real-timeCSanalysis软件采集数据并对数据进行分析。五、注意事项1、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。2、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。3、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。4、每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。5、气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。6、如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。六、思考题1、试述反相离子对色谱的分离机理。2、试述本实验氨基酸分析的基本原理和方法，除了本方法外，还有那些氨基酸分析方法？