高分子磁性微球

磁性微球磁性高分子微球是近年发展起来的一种新型磁性材料，是通过适当方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。磁性复合微球不仅具有普通高分子微球的众多特性还具有磁响应性，所以不仅能够通过共聚及表面改性等方法赋予其表面功能基(如-OH、-COOH、-CHO、-NH2,等)，还能在外加磁场作用下具有导向功能。目前，磁性复合微球已广泛用于生物医学、细胞学和分离工程等诸多领域。一、功能化高分子磁性微球具有生物活性的高分子生物材料是高分子功能团,可以作为生物活性物质的载体,另一方科学与生命科学之间相互渗透而产生的一个重面又因其具有超顺磁性,在外加磁场的作用下要的边缘领域,是近50年以来高分子科学发展能快速、简单的分离,使其在生物工程(固定化的一个重要特征。功能化的高分子磁性微球一酶)、生物医学(靶向药物、酶标、临床诊断)、细胞方面因其具有能够与生物活性物质反应的特殊学(细胞分离、细胞标记)等领域的研究日益活跃,并显示出较好的应用前景。（1）功能化磁性微球与生物大分子的作用机理包覆磁性颗粒的高分子材料带有多种具有反应活性的功能基团,如羧基(—COOH)、羟基(—0H)、氨基(—NH2)、巯基(—SH)等,这些功能基团能够与生物高分子(氨基酸、蛋白质、酶等)中的活性基团共价结合,从而实现磁性微球作为生物载体的功能。同时通过磁性微球的功能基团也可在颗粒表面偶联特异性的靶向分子,如特异性配体、单克隆抗体等,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄粒作用下进入细胞内,可实现安全有效地用作靶向性药物、基因治疗、细胞表面标记、同位素标记等。瑞典皇家理工学院的Mikhaylova等[3]利用表面含有的—NH2功能团的磁性微球运载BSA(牛血清蛋白),先将功能基团—NH2修饰到磁性纳米颗粒表面,然后将BSA中的—COOH活化,利用—COOH和磁性微球表面的—NH2形成肽键,从而实现磁性微球对BSA的运载。红外光谱(FTIR)证实BSA分子成功地联接到磁性纳米颗粒上;化学分析表明表面功能化的磁性纳米粒子对BSA的运载能力远远大于未功能化的磁性纳米颗粒;磁性测试表明,磁性微球表面包覆BSA分子后,仍呈超顺磁性,但饱和磁化强度有所降低。沈鹤柏等[4]用微乳液的方法将SiO2包覆在磁性粒子γ-Fe2O3表面,通过脱水反应在纳米颗粒表面引入3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)进行表面巯基化,然后使修饰有过硫键的DNA分子与MPTS分子中的—SH配位基形成-S-S-双键,从而将磁性微球与生物大分子键合在一起。表面增强拉曼光谱(SERS)分析证实DNA被有效地联接到磁性纳米粒子表面。（2）磁性微球的功能化方法磁性微球的功能化主要通过四种方法来实现:共混包埋法、界面吸附法、活化溶胀法和单体聚合法。○1共混包埋法：共混包埋法制备磁性高分子微球主要是通过范德华力、氢键、配位键或共价键等作用,使溶解的高分子链缠绕在磁性纳米颗粒表面,形成高分子包覆的磁性微球。Bahar等[20]通过共混包埋法将悬浮有Fe3O4的油相倒入水相,经搅拌后在室温下蒸发出油相溶剂氯仿,制得带有反应性醛基的磁性聚苯乙烯微球。○2界面吸附法是利用纳米颗粒本身的表面效应来制备磁性微球的一种方法。纳米颗粒由于表面原子的周围缺少相邻的原子,导致了表面原子的晶体场环境和结合能与内部的原子不同,具有很高的化学活性;并且,纳米颗粒表面原子数与总原子数之比随着粒径的减小而急剧增大。这使得纳米颗粒表面能大大增加,从而比较容易与其它原子相结合而稳定下来。生物大分子大都是两性分子,因而当与纳米颗粒均匀混合后,调节溶液的pH值使生物大分子与纳米颗粒表面携带相反的电荷,可使生物大分子借助于静电引力吸附在纳米颗粒的表面,这是界面吸附法的理论依据。Sousa等[21]研究了两种酸性氨基酸L-天(冬)氨酸和谷氨酸在γ-Fe2O3纳米颗粒表面的吸附行为,研究表明,当pH=3.01时,氨基酸的吸附量最大,拉曼光谱和傅立叶变换红外光谱测试表明两种氨基酸均可吸附到γ-Fe2O3纳米颗粒的表面,氨基酸分子中的—COOH和γ-Fe2O3微粒表面的—OH以形成羧酸酯的形式化学成键结合。○3活化溶胀法是Ugelstad等[22]创立的一种制备高分子磁性微球的有效方法。活化溶胀法制备磁性高分子微球一般包括四个步骤:(1)采用种子聚合技术制备单分散大孔型聚苯乙烯微球;(2)对微球孔内、外进行磺化或硝化处理以使其具有亲水性界面;(3)浸泡微球于铁盐水溶液中,在适当的反应条件下使超顺磁性磁性纳米颗粒在孔内合成;(4)选用一种含活性功能基团的单体对微球进行溶胀、聚合、包被,使微球孔道封闭,实现表面功能化。○4单体聚合法是指在磁性粒子和单体存在下,加入引发剂、稳定剂等进行聚合反应,得到内部包含有磁微粒的高分子微球。迄今为止,单体聚合法合成磁性微球的方法主要有:悬浮聚合、分散聚合、乳液聚合等。单体聚合法成功的关键在于确保单体的聚合反应在磁性纳米颗粒表面顺利进行。当然，除了上述四种常见方法外，还有一些其他方法，比如悬浮聚合法等新方法。近十年来,功能化高分子磁性微球的研究取得了很大进展,但以下几个问题需要进一步的研究。(1)探索新的磁性纳米颗粒的制备方法,包括对传统方法的改进,多种方法结合使用或与生物技术、激光技术等新的科技成就相结合,找到最佳的合成工艺,从而制备出更经济实用的磁性纳米颗粒;(2)解决纳米微粒在基材中的有效、可控和稳定分散,为进一步利用磁性纳米颗粒制备功能化高分子磁性微球扫清障碍。二、免疫磁性微球免疫磁性微球技术是免疫学和磁载体技术结合而发展起来的一项新技术,是20世纪70年代兴起的一类新型材料。微球在磁场中具有顺磁性和高分子粒子的特性。微球的顺磁性使固液分离更加简便,可省去过滤等繁杂的传统操作;而且微球颗粒小,比表面积大,与其它物质偶联容量大,悬浮稳定性好,有利于偶联反应顺利地进行,有着很好的研究和应用前景。随着科学技术特别是分子生物学的发展,抗体制备技术获得了革命性的进展,促进了免疫磁性微球(Immunomagneticbeads,IMB)的出现。IMB是包被有单克隆抗体的磁性微球,可与含有相应抗原的靶物质特异性地结合形成新的复合物。通过磁场时,这种复合物可被滞留,与其它组分相分离,该过程称为免疫磁性分离法(ImmunomagneticSeparation)。它以免疫学为基础,渗透到生理、病理、药理、微生物、生化及分子遗传学等各个领域,是近年来国内外研究比较热的一种新的免疫学技术。免疫磁性分离简便易行,分离纯度高,保留靶物质活性,且高效、快速、低毒,广泛应用于细胞分离和提纯、免疫检测、核酸分析和基因工程、作靶向释药的载体等领域。○1免疫磁性微球的结构和性质（图1免疫磁性微球结构）免疫磁球由载体微球和免疫配基结合而成。理想的免疫磁性微球为均匀的球形、具有超顺磁性及保护性壳的粒子,其结构为:核心为顺磁性粒子,核心外层包裹高分子材料和最外层的免疫配基构成(见图1)。形成免疫磁性微球的关键是磁载载体,按照其结构的不同可以分为三大类:1)壳核结构,高分子材料作为核,磁性材料作为壳层。2)核-壳结构,磁性材料为核,高分子材料组成壳层。3)壳-核-壳结构,外层和内层为高分子材料,中间为磁性材料。用作免疫磁性微球载体的磁性微球主要是后两种,其中核壳式结构为最多。-○2免疫磁性激球的分离原理磁性激球经过一定处理后,可将抗体结合到磁珠上,形成免疫磁性微球,免疫磁性微球不同的磁响应性,在磁力作用下,该复合物发生力学移动,从而达到分离抗原的目的。免疫磁性微球分离有两种方式:直接法和间接法。直接法指用抗体包被磁性粒子,再与抗原结合形成复合物,在磁场中与其它物质分离;间接法是先用第二抗体包被磁珠,使磁珠成为第二抗体的载体,抗原与第一抗体结合后再加入带有第二抗体的磁珠,磁珠上的第二抗体便与第一抗体结合,形成复合物。在磁场中该复合物得到分离。借助于亲和素—生物素系统,免疫磁珠还可与非蛋白物质结合,如DNA和RNA分子等,使IMB得以应用于更广泛的领域。○3免疫磁性微球的应用免疫磁性激球由于具有高效、快速、操作简单、生物相容性好等优点,在细胞分离和提纯、体外扩增、免疫检测、核酸分析和基因工程、HLA分型、靶向释药载体、固定化酶等领域都得到了广泛地应用。用于细胞分离和提纯传统的细胞分离技术需时较长且成本很高,而使用磁性激载体偶联相应抗体进行细胞亲和分离,不仅简便快速,而且可以在接近细胞正常生活状态的情况下进行,对细胞活性无显著影响。早在20世纪80年代初期,Ugelstad就提出用磁性微粒分离细胞,后由挪威Dynal公司制成免疫磁珠出售,可用于各种细胞的分离。免疫磁性微球在细胞分离方面还广泛应用于:分离纯化特定细胞,进行生理病理研究;从外周血中去除T细胞或者γδT细胞,用于白血病、艾滋病的治疗;造血干细胞的分离纯化,可用于造血干细胞的移植,治疗恶性血液病和实体瘤,以及遗传病和肿瘤的基因治疗。目前应用免疫磁性微球进行细胞分离的技术已经比较成熟,研究的热点转为使用该法获得特定细胞作为研究对象。三、磁性微球的生物学应用磁性微球作为一种新型功能材料,在生物医学、细胞学和生物工程学等领域被广泛地应用于生物目标产品的快速分离;在临床医学方面被广泛应用于靶向给药。磁性生物高分子微球一般是通过包埋法制备的,它主要是将磁性粒子分散于生物大分子的溶液中,通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段得到磁性微球。Dekker[7]将磁性粒子悬浮于聚乙烯亚胺(PEI)溶液中,通过过滤,干燥处理得到外包PEI的磁性微球;Cuyper等[8]用磷脂处理纳米级的磁性粒子,制得磁性脂质体微球;Gupta等[9]用牛血清清蛋白和棉籽油对磁性粒子进行处理,得到外包牛血清清蛋白的磁性微球;Hasegama等[10]利用葡聚糖制得了葡聚糖磁性微球。○1磁性微球生物分离由于磁性微球粒径小,比表面积大,故而偶联容量大,悬浮稳定性好,便于高效地与目标产物偶联;又因其具有超顺磁性,在外磁场的作用下固液相的分离十分简单,可省去离心、过滤等繁杂操作,在细胞分离、分类、蛋白质提纯、核酸分离等领域有着广泛的应用。○2蛋白质的提纯以磁性微球为固相介质对蛋白质进行提纯是一项新兴的蛋白分离技术。目前已经成功地对溶胞产物、血浆、原生质和腹水中的各种蛋白质进行了分离和纯化。传统的蛋白质分离方法如盐析、有机溶剂沉淀到分离的目的,分离过程繁杂,而且目标蛋白质的损失大。而蛋白质的磁分离是通过对磁性微球表面的改性,共价结合能被目标蛋白质识别和可逆结合的配基,然后进行目标蛋白质的分离。在磁分离过程中,将磁性微球直接放入含有目标蛋白质的混合溶液中,目标蛋白质与磁性微球紧密结合,然后利用外部磁场进行分离。整个分离过程不需对混合溶液的pH值、温度、离子强度和介电常数进行调整,从而避免了传统分离过程中蛋白质的损失。与传统分离方法相比较,蛋白质的磁分离技术具有快速、高纯、高收率等优点。○3核酸的分离磁性微球还可以用于分子生物学领域,进行DNA和RNA的分离、纯化。传统的核酸分离技术有超离心密度梯度技术和凝胶电泳等。如目前实验室纯化质粒DNA最常用的啡啶溴红-氯化铯密度梯度平衡超离心方法,分析和提纯RNA和DNA的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等,这些纯化方法步骤繁杂、费时长、收率低。磁性微球分离核酸,是基于碱基配对原则,通过偶合与目标核酸碱基互补的一段引物链而达到分离目标核酸的目的,这种分离方法简单、快速、选择性高。例如偶合有Oligo(dT)25的磁性微球可以快速、高效地对mRNA进行纯化,纯化后的mRNA可以直接用来建立cDNA文库和RT-PCR扩增。○4磁性微球靶向给药药物制剂的给药途径与方法对药物效果至关重要。口服给药由于受胃肠上皮细胞和肝脏中各酶系的降解和代谢两种首过效应的影响,许多药物很大一部分被代谢;静脉注射由于药物均匀分散于全身循环系统中,分布于靶组织的量甚少。要提高靶区的药浓度就必须普遍提高系统的药物浓度,而增加剂量往往也增加了药物的不良反应和毒副作用,因此必须改变给药途径。靶向给药或称定位释放药物,即把