高效液相色谱简介及操作.

高效液相色谱High-PerformanceLiquidChromatography，HPLC高效液相色谱概述及原理主要注意事项基本操作步骤高效液相色谱仪的结构主要内容1234一、高效液相色谱概述及原理•高效液相色谱法（HPLC）是在20世纪70年代在经典液相色谱和气相色谱的基础上迅速发展起来的一种高效、快速的分离分析技术。1.色谱的演化•色谱：由于不同的组分与固定相作用强弱不同，在一定的推动力下，它们在固定相中滞留的时间长短不一，从而使它们按一定顺序从色谱柱中先后流出。经典的柱色谱经典的柱色谱•渐渐地，人们以传统色谱为蓝本开发了气相色谱气相色谱示意图经典的柱色谱•高效液相色谱：效仿气相色谱，用高压输液泵将流动相输入高柱效色谱柱，使其在柱内快速流动，并在柱末端附加检测器检测分离情况。高效液相色谱就这样诞生了。高效液相色谱仪就这样诞生了LCGCHPLC填料颗粒小（2~10μm），受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加15~30MPa的高压。由于采用高压，载液在色谱柱内的流速可达l~10mL／min，因而所需分析时间少。使用细、规则、孔浅的颗粒做为固定相，分离效率大大提高。采用紫外、荧光、蒸发激光散射、电化学、质谱等检测器，检测灵敏度高。紫外检测器检测限可达0.01ng；荧光和电化学检测器可达0.1pg。2.为什么叫高效液相色谱???HPLC和经典液相色谱法的比较3.高效液相色谱法的分类•通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。4.如何阅读色谱图？？tR：保留时间；tM：死时间；：调整保留时间；W：峰宽•定性分析：在同一色谱系统中相同物质具有相同的保留值•定量分析：组分含量与其响应值（峰高或面积）成正比5.如何评价色谱峰？？•柱效：描述被分离组分的集中程度。柱效越高，组分越集中，对应色谱峰的峰宽越窄。可用理论塔板高度H描述。H越小，柱效越高。•选择性：描述不同组分的分离程度。选择性越高两个色谱峰顶相距越远。用R表示nLH（a）柱效和分离度都不好；（b）分离度高，柱效低；（c）理想色谱峰•用分离度R可以描述选择性和柱效的总效能R值越大，表明两组分的分离程度越高，R=1.0时，分离程度可达98%，R1.0时两峰有部分重叠，R=1.5时，分离程度达到99.7%.所以，通常用R=1.5作为相邻两色谱峰完全分离的指标.分析未知物质------联用技术•色谱-质谱联用•色谱-核磁共振联用•色谱-傅氏转换红外线光谱分析仪联用二、高效液相色谱仪的结构液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统以及检测和记录系统四大部分组成。此外，可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。高效液相色谱仪结构流程图1高压输液系统高压输液系统有贮液器、高压泵及压力表等组成，核心部件是高压泵。（1）贮液器流动相贮液器，一般由玻璃、不锈钢或聚四氟乙烯塑料制成，常用体积为0.5~2L。流动相溶剂放入贮液器之前必须经过过滤和脱气处理。常用脱气方法：超声脱气、加热脱气、真空脱气、吹氮脱气等。（2）高压输液泵主要部件之一，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性，常用的压力范围：(150～350)×105Pa。输液泵应具备如下性能：①流量稳定；②流量范围宽；③输出压力高；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。高压泵的分类往复式柱塞泵分类恒流泵恒压泵螺旋注射泵柱塞往复泵隔膜往复泵2进样系统进样方式：注射器进样、阀进样、自动进样。早期使用注射器进样，现在大都使用耐高压的六通阀进样或自动进样。六通阀的结构：色谱柱是高效液相色谱的心脏。柱管多用不锈钢制成。两端的柱接头内装有筛板，防止填料漏出。填料的粒度多为0.2-20μm(5-10μm)。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。常规分析柱：内径2~5mm(常用4.6mm，3.9mm)，柱长10~30cm(15cm，25cm居多）。3分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。4检测系统主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓度变化，并由工作站记录数据，定性、定量分析。高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器等。原理：朗伯-比尔定律a.紫外检测器(UVD)：应用最广泛的检测器。特点：使用面广；灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。缺点：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。b.示差折光检测器(RID)原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度。特点：通用性检测器；对温度变化比较敏感，要保持在±0.001℃；灵敏度低(10-6g)；对溶剂变化敏感，不适用于梯度洗脱。凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。c.荧光检测器(FLD)原理:某些溶质在紫外光激发后能发射可见光(荧光)的性质检测。特点:选择性检测器，灵敏度比紫外检测器高2-3个数量级，可达到10-12g；选择性好，对流量和温度敏感性低。缺点：只适合于能产生荧光的物质的检测。只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。d.蒸发光散射检测器(ELSD)通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。工作原理:适用检测挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类，高级脂肪酸，磷脂，维生素，氨基酸，甘油三酯及甾体等。适用范围：5数据处理系统该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。三、高效液相色谱基本操作步骤（1）检查电源线连接是否正确后打开电源开关（2）泵体及流路内的气泡排除（3）正确连接色谱柱注意流向标志，切勿反接（4）系统平衡•第一步：先用甲醇或乙腈冲洗流路约20分钟，平衡活化色谱柱，并赶走管路中的杂质和水分。•第二步：平衡色谱柱方法一：若流动相为有机相与水相的混合物，则第一步完成后，按照分析样品的需要调节有机相与水相的比例后冲洗流路约30分钟后，待基线走平后即可进样。方法二：若流动相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸，则第一步完成后，先用95%的去离子水冲洗流路约20分钟后，再按照分析样品的需要调节流动相的比例，冲洗流路约30分钟，待基线走平后即可进样。（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯）（6）测定样品（7）清洗仪器色谱柱及流路清洗进样阀清洗进样针清洗四、主要注意事项1泵使用的注意事项•防止任何固体微粒进入泵体（用0.22um或0.45um的微孔滤膜过滤）•流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。•泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、密封圈，最终产生漏液。•输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。•流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性和分析结果。2色谱柱使用的注意事项3其他注意事项•色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。•当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般为甲醇）。•每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。•未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁止直接进样分析。•要注意流动相的脱气。•避免使用高粘度的溶剂作为流动相。•使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或缓冲液建议不超过两天，最好每天更换。ThankYou!