高质量浓度肿瘤坏死因子α对骨髓间充质干细胞的损伤作用

中国组织工程研究第20卷第36期2016–09–02出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchSeptember2,2016Vol.20,No.36ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH5325·研究原著·李洁媚，女，1990年生，广东省梅县人，汉族，2016年广东医科大学毕业，硕士，主要从事神经病理生理学研究。并列第一作者：王槐高，男，1978年生，湖南省武冈市人，汉族，2006年广东医科大学毕业，硕士，讲师，主要从事神经病理生理学研究。通讯作者：周艳芳，博士，广东医科大学病理生理学教研室，广东省东莞市523808中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)36-05325-07稿件接受：2016-06-24高质量浓度肿瘤坏死因子α对骨髓间充质干细胞的损伤作用李洁媚，王槐高，邓达师，卢芳，张琛琛，刘国增，周艳芳(广东医科大学病理生理学教研室，广东省东莞市523808)引用本文：李洁媚，王槐高，邓达师，卢芳，张琛琛，刘国增，周艳芳.高质量浓度肿瘤坏死因子α对骨髓间充质干细胞的损伤作用[J].中国组织工程研究，2016，20(36):5325-5331.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.001ORCID:0000-0002-8477-6564(周艳芳)文章快速阅读：文题释义：原代培养：指直接从机体取细胞、组织和器官后立即进行培养，较为严格说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际操作上通常把第1代至第10代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。肿瘤坏死因子α：可参与脑缺血后的损伤修复过程，调节脑缺血后血管发生和神经发生，在脑组织损伤恢复及神经保护方面具有重要意义。肿瘤坏死因子α对细胞的保护效应非常复杂，与其处理浓度、时间、实验模型、实验方法以及细胞来源息息相关。摘要背景：干细胞移植在脑缺血治疗中取得了良好效果，如何减少移植细胞的损伤成为治疗重点。目的：探讨肿瘤坏死因子α对骨髓间充质干细胞的损伤作用及可能机制。方法：原代培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，高质量浓度肿瘤坏死因子α(200μg/L)处理6h，MTT比色法检测细胞存活率，Hoechst33342染色观测细胞凋亡，Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡率，丙二醛、超氧化物歧化酶试剂盒检测细胞氧化应激水平，Westernblot法检测Akt、p-Akt、FoxO1及p-FoxO1蛋白表达改变。结果与结论：①相比对照组，高质量浓度肿瘤坏死因子α处理6h后，骨髓间充质干细胞存活率下降，凋亡率上升；②肿瘤坏死因子α作用后，G1期和G2期细胞比例降低，S期细胞比例增高，氧化应激水平增高，p-Akt、p-FoxO1蛋白表达降低，差异有显著性意义(P0.05)；③结果提示，高质量浓度肿瘤坏死因子α可诱导骨髓间充质干细胞周期阻滞，诱导凋亡，提高其氧化应激水平，其损伤机制可能与抑制Akt-FoxO1信号通路有关。关键词：干细胞；骨髓干细胞；肿瘤坏死因子α；骨髓间充质干细胞；Akt；FoxO1；凋亡主题词：肿瘤坏死因子α；骨髓；间质干细胞；细胞凋亡；组织工程基金资助：广东省社会发展领域科技计划项目(2013B021800073)；东莞市科技局学科科研项目(2014108101049)肿瘤坏死因子α对骨髓间充质干细胞的作用李洁媚，等.高质量浓度肿瘤坏死因子α对骨髓间充质干细胞的损伤作用P.O.Box10002,Shenyang110180:ZhouYan-fang,M.D.,DepartmentofPathophysiology,GuangdongMedicalUniversity,Dongguan525808,GuangdongProvince,ChinaTumornecrosisfactoralpha-inducedapoptosisinbonemarrowmesenchymalstemcellsLiJie-mei,WangHuai-gao,DengDa-shi,LuFang,ZhangChen-chen,LiuGuo-zeng,ZhouYan-fang(DepartmentofPathophysiology,GuangdongMedicalUniversity,Dongguan525808,GuangdongProvince,China)AbstractBACKGROUND:Stemcelltransplantationhasachievedgoodresultsinthetreatmentofcerebralischemia,andhowtoreduceapoptosisoftransplantedcellshasbecomethefocusofthetherapy.OBJECTIVE:Toinvestigatetheinjuredeffectoftumornecrosisfactoralpha(TNF-α)onbonemarrowmesenchymalstemcellsanditsmechanism.METHODS:PrimaryculturedbonemarrowmesenchymalstemcellsfromSprague-Dawleyratsweretreatedwith200μg/LTNF-αfor6hours.CellvitalitywasassayedbyMTT,andcellapoptosiswasobservedbyHoechst33342staining.ApoptoticratewasdetectedbyAnnexin-V/PIdoublestaining.Levelofoxidativestresswasevaluatedbydeterminationofmalondialdehydeandsuperoxidedismutaselevels.Theproteinexpressionsofphosphorylated-Akt,Akt,phosphorylated-FoxO1,FoxO1weredetectedbywesternblotanalysis.RESULTSANDCONCLUSION:AftertreatmentwithTNF-α,thecellvitalityofbonemarrowmesenchymalstemcellsdecreased,theapoptoticrateincreased,andthecellswerearrestedintheSphase.Moreover,theoxidativestresslevelwaselevated,andtheproteinexpressionofphosphorylated-Aktandphosphorylated-FoxO1wassignificantlyreducedcomparedwiththecontrolgroup(P0.05).TheseresultssuggestthatTNF-αathighlevelcontributestotheS-stagearrest,responsiblefortheapoptosisprocessesofbonemarrowmesenchymalstemcellsviatheAkt-FoxO1pathway.Subjectheadings:TumorNecrosisFactor-alpha;BoneMarrow;MesenchymalStemCells;Apoptosis;TissueEngineeringFunding:theScientificResearchPlanforSocialDevelopmentofGuangdongProvince,No.2013B021800073;theScientificResearchProjectofDongguanScienceandTechnologyDepartment,No.2014108101049Citethisarticle:LiJM,WangHG,DengDS,LuF,ZhangCC,LiuGZ,ZhouYF.Tumornecrosisfactoralpha-inducedapoptosisinbonemarrowmesenchymalstemcells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(36):5325-5331.0引言Introduction缺血性脑卒中病情的恶化往往与随后发生的脑组织局部血流量下降、脑水肿、神经元损害等相关，其中炎性反应是脑缺血再灌注损伤的重要机制之一[1-4]。众多研究显示，骨髓间充质干细胞移植治疗脑卒中具有抑制神经损伤[5-6]、减少脑缺血面积[5]、改善脑血流[7]、减少胶质瘢痕厚度、促进血管新生[8]、促进细胞因子及营养因子表达[9-10]、改善局部微环境[11]、调节免疫[9，12]、改善脱髓鞘并能迁移至缺血区分化为神经细胞替代缺血区神经元功能等多重神经修复作用[13-14]。但是骨髓间充质干细胞移植后大量迅速凋亡显著降低了移植效益，限制了其广泛的应用[15-18]。因此，研究移植后骨髓间充质干细胞的凋亡相关机制对提高移植效果有重要的治疗意义。实验在体外培养骨髓间充质干细胞，用高质量浓度肿瘤坏死因子α刺激模拟大脑缺血再灌注区域的炎症微环境，观察其对骨髓间充质干细胞的损伤作用并探讨其相关分子机制，为将来的临床应用提供一定的实验依据。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞学体外实验。1.2时间及地点实验于2015年2至12月在广东医学院东莞校区科研平台完成。1.3材料SPF级雄性SD大鼠2只，4周龄，体质量80-100g，由广东医科大学动物实验中心提供。1.4实验方法1.4.1骨髓间充质干细胞分离及扩增培养SD大鼠脱臼处死，无菌条件下取双侧股骨，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液冲出骨髓腔中的骨髓细胞，离心10min后弃上清，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞，培养于37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2的培养箱中，7d左右细胞爬满瓶底，按常规方法传代。待细胞传至第3-7代时用于实验。李洁媚，等.高质量浓度肿瘤坏死因子α对骨髓间充质干细胞的损伤作用ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH5327将骨髓间充质干细胞随机分为对照组、实验组。实验组加入200μg/L肿瘤坏死因子α，对照组加入对应体积PBS。1.4.2MTT法检测肿瘤坏死因子α对骨髓间充质干细胞活力的影响收集对数期细胞，5%胰酶消化成单细胞悬液，置于96孔培养板内，每孔200μL(5×104个/孔)，同时设置空白组(不含细胞)。细胞贴壁后加入处理药物干预6h，每孔加5g/LMTT20μL，继续培养4h，吸去上清液，每孔加150μL二甲基亚砜，振摇10min，使结晶充分溶解。在酶标仪上波长为450nm处检测各孔吸光度值。每组设8个复孔，实验重复4次。按