鸡传染性支气管炎病毒疫苗研究进展

鸡传染性支气管炎病毒疫苗研究进展专业：预防兽医学号：***姓名：***-1-鸡传染性支气管炎病毒疫苗研究进展摘要：鸡传染性支气管炎（Avianinfectiousbronchitis，IB）是危害养鸡业的主要疫病之一。由于IBV具有高度变异的特点，产生了众多血清型和基因型，而不同血清型间缺乏交叉免疫性，使传统疫苗难以达到满意的效果。随着IBV分子生物学研究、免疫机制探索以及病原变异机制探讨等工作的逐步深入，新型疫苗的研究工作也取得了一系列进展。本文对IBV疫苗研究现状进行了综述，为IB的免疫防控及相关研究提供参考。关键词：传染性支气管炎；传染性支气管炎病毒；疫苗鸡传染性支气管炎（InfectiousBronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（AvianInfectiousbronchitisvirus，IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，呈世界分布，是严重危害养鸡业的重大传染病之一[1]。以呼吸道症状、产蛋率和品质下降、肾脏病变等为特征。鸡不分年龄、性别和品种均易感，但主要侵害1周龄～4周龄的幼鸡[2]。自1931年Schalk和Hawn首次报道本病以来，IBV不断发生变异，毒株由最早的呼吸型向肾型、腺胃型、肠型等转变。近年来新的变异株不断出现，导致鸡传染性支气管炎的不断暴发，在规模化饲养条件下，病毒基因型更为复杂，防控难度更大，给世界各国的养鸡业带来巨大的经济损失[3-5]。随着IBV分子生物学研究、免疫机制探索以及病原变异机制探讨等工作的逐步深入，IBV疫苗研究工作也取得了一系列进展。本文综述如下：1弱毒疫苗弱毒疫苗是由抗原性良好的毒株连续通过鸡胚25代以上获得的，在使用的弱毒疫苗中以荷兰株H52和H120应用最为广泛，且具有良好的免疫保护性，但该疫苗对肾型传染性支气管炎的预防无效。原因在于肾型和呼吸道型支气管炎的免疫机制存在很大差异，因此在较大程度上影响了疫苗的保护作用。中国兽药监察所王志伦、肖玉芳等专家经多年努力，从国内分离、筛选并成功研制了肾型IBW93疫苗，该疫苗不仅对肾型传染性支气管炎有良好效果，对呼吸型和变异性传染性支气管炎也有良好预防效果[6]。活疫苗的优点是能有效刺激机体的体液与细胞免疫，方便生产且成本低，但其可在感染机体中引起持续的潜伏感染，并有可能成为IBV突变的主体和重组变异的供体。另外，弱毒疫苗还存在着一个隐患就是在使用过程中容易毒力返强。由于IBV具有高度的变异性，病毒基因组RNA的点突变、缺失和插入突变以及不同毒株（包括疫苗毒株）基因组问的同源重组均可导致新的变异株产生。因此，使用弱毒疫苗无法从根本上彻底控制IB的流行。-2-2灭活疫苗灭活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返强的问题，且能激发良好的体液免疫反应。由于IB血清型的多样性，油乳剂等灭活苗无法阻止IBV变异株引起的IB的爆发，王红宁[7]对我国IBV进行了分子流行病学调查，指出用多价灭活疫苗预防本病更为有效，并研制了多种多价油乳剂灭活疫苗，经区域试验证明该疫苗安全，并能有效预防IB。但灭活疫苗副作用大，免疫后能够造成较严重的和持续时间较长的局部反应，况且灭活疫苗对冠状病毒感染的免疫效果不确实[8]。3基因工程疫苗随着分子生物学技术的发展，基因工程疫苗的出现为IB疫苗研制带来了新的希望。3.1亚单位疫苗亚单位疫苗是指用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核细胞或真核细胞，使其高效表达分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原，加入佐剂即制成亚单位疫苗。其具有高效、广谱、无毒和特异性强等优点。常用的表达系统为大肠杆菌系统、酵母菌表达系统、昆虫细胞和植物表达系统。纤突蛋白S1基因是IBV的主要免疫原基因[9]。SeonCS等研究了重组杆状病毒表达的S1蛋白的免疫效果，发现单独用该S1糖蛋白免疫对鸡的保护率可达50％，而用异源弱毒疫苗株H120初免再用重组杆状病毒S1糖蛋白进行加强免疫，保护率可达到83％，表明S1糖蛋白免疫是一种行之有效的增强免疫的方法[10]。国内廖明也证实在昆虫细胞中的表达IBVS1基因，即使N-糖基化不完全，分子量小于天然蛋白，但仍有良好的免疫原性[11]。尽管这些表达系统存在一定的缺陷，且IBVS1基因中和位点的高度构象依赖性一定程度上妨碍了S1亚单位蛋白疫苗启动免疫的有效性，但有资料表明单独使用传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗免疫仍可产生一定的保护免疫效应。对于植物表达系统表达的S1亚单位疫苗，有研究表明，经多次反复免疫，可形成确实有效的免疫保护。王红宁等IBVS1基因片段导入玉米表达载体进行表达[12]。周继勇等利用根瘤菌将IBV全长S基因转入马铃薯中表达，然后提取免疫原，三次免疫仔鸡后，发现血清中产生了中和抗体，可抵抗同型病毒的攻击，细胞免疫应答方面，其脾脏可在体外分泌IL-2（Interleuldn2）并发生T淋巴细胞增殖反应[13]。这表明转植物表达的IBVS1糖蛋白可在鸡体激发体液免疫和细胞免疫，是较有前途的疫苗研究方向。此外，王红宁等研究了基于B细胞表位和T细胞表位的IB融合蛋白抗病毒的免疫效果，发现融合蛋白也能激发特异性体液和细胞免疫，动物保护率可达73％，开拓了IBV人工疫苗的一个新方向[14]。-3-3.2核酸疫苗核酸疫苗是由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。进入机体的核酸疫苗不与宿主染色体整合，目的基因可在动物体内表达，进而刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答，是一种极有希望取代传统疫苗的新型基因疫苗，一般分为DNA疫苗和RNA疫苗。3.2.1DNA疫苗在DNA疫苗的免疫原基因选择上，有研究认为，IBV核蛋白在激发细胞免疫在抗感染中发挥了作用。Boots发现IBVN蛋白上存在CD4表位，认为有必要研究N基因的核酸疫苗免疫保护情况。刘思国用核蛋白基因构建真核表达质粒，两次免疫雏鸡一周后攻毒，发现保护率可达40％[15]。Minglong用含IBVN蛋白C末端120aa的cDNA片段的重组质粒接种雏鸡，证实了在缺乏IBS1蛋白时，N蛋白基因可保护雏鸡抵抗急性感染[16]。近年来，随着核酸疫苗研究的深入和发展，众多核酸免疫佐剂因子也越来越为人们重视，如CpGDNA序列、IL序列、GM-CSF序列等。CpGDNA序列，又称免疫刺激DNA序列（ISS），在体外可直接促进B淋巴细胞增殖、Ig的分泌；促进单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞共刺激分子的表达和分泌多种细胞因子[17]。焦新安将含CpG基序插入到DNA疫苗载体中，通过细菌运送免疫动物，发现CpG基序除增强细菌DNA和ODN全身性免疫应答外，还可作为有效的黏膜佐剂诱生局部的黏膜IgA，对经黏膜途径进入机体的抗原可产生较好的保护性免疫应答。王红宁则将IBVS1DNA疫苗与具有增强免疫应答的鸡GM-CSF共同免疫动物，进行攻毒实验，发现与鸡GM-CSF共同免疫的DNA疫苗比单纯的DNA免疫组保护率要高13.4％，增强效果极显著。此研究中，GM-CSF糖蛋白相当于佐剂分子，作用就在于能够促进造血干细胞的增殖和分化，影响树突状细胞的分化、成熟和MHC和共刺激分子的表达。此外在DNA疫苗的安全性方面，王红宁研究了禽传染性支气管炎DNA疫苗在鸡体内的分布和重组情况，发现该疫苗免疫后分布于全身，持续分布6d，组织基因组中无基因整合现象，证实该DNA疫苗具有一定的安全性[18]。3.2.2RNA疫苗陆承平通过设计针对多聚酶Pol、膜蛋白M、核蛋白N基因的12个siRNA（短RNA干涉）片段，分别在Vero细胞、9日龄SPF鸡胚上进行针对IBV增殖的RNA干扰性试验，结果显示：来自Pol、N靶序列的2个siRNA在Vero细胞上及鸡胚上均对IBV增殖产生明显的干扰作用，干扰效果与siRNA剂量、mRNA互补的负链siRNA存在情况。首次证实IBV增殖过程中存在siRNA干扰现象，为控制IBV提供了新手段[19]。3.3活病毒载体疫苗活病毒载体疫苗是用基因工程方法将一种病原免疫相关基因整合进另一种载体基因组DNA的复制非必需片段中构成的重组活载体疫苗。在被接种的动物体内，特定免疫原基因可随重组载体的复制而适量表达。常作为载体的病毒有痘苗病毒、禽痘病毒、疱疹病毒、腺病毒和反转录病毒等。-4-3.3.1禽痘病毒载体随着对禽痘病毒分子生物学研究的逐步深入，利用禽痘病毒载体表达外源基因已经成为当前新型疫苗研究最活跃的领域之一。利用禽痘病毒作载体其特征为，病毒不能整合进入基因组；可携带多个基因，宿主细胞谱广；瞬间表达转基因。但缺点是难以大量产生。在美国，新城疫和禽流感就分别有两个重组鸡痘病毒产品得到了美国农业部的批准，现在表达H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗也获准在紧急情况下使用，由此可见鸡痘病毒（Fowlpoxvirus，FPV）已经成为研究开发并逐渐转向实际应用的一个最为成功的病毒载体，尤其在动物传染病的控制上具有广阔的应用前景，既可用于禽类重组病毒疫苗的研究，又可作为哺乳动物的非复制型载体。WangX等用重组痘病毒表达的马萨诸塞4l株的S1基因免疫鸡，结果显示翅下免疫接种效果更好[20]。YuL等人则用IBV的核蛋白（N蛋白）C末端120个氨基酸进行预防研究，实验证明此种方法也能诱导了IBV毒株交叉免疫[21]。国内田占成则比较了痘病毒疫苗与弱毒疫苗的免疫效果，结果两组均获得100％保护，但重组疫苗组抗体水平不及弱毒疫苗组这说明此疫苗仍存在许多有待改进的地方[22]。3.3.2腺病毒载体黏膜免疫预防IBV感染中支气管，泪腺，输卵管局部产生抗体的重要性已被证明。因此，用复制缺陷性载体表达IBV免疫保护性抗原诱导黏膜免疫的疫苗代替弱毒苗是较为理想的。重组腺病毒作为基因载体已在基因转移，载体疫苗和基因治疗等各个方面得到广泛应用，这主要是由于复制缺陷性腺病毒有着独特的优点：①腺病毒可感染的宿主细胞谱广，包括了一些非分裂细胞和末端分化细胞；②腺病毒可容纳的外源片段较大，可达7.5kb；③E1基因的缺失，重组腺病毒是缺陷性的，这意味着在感染细胞内不会产生感染性病毒粒子；④重组腺病毒可同时经交叉递呈抗原和细胞的活化作用诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，且其免疫期持续时间长；⑤腺病毒载体能有效的转导非分裂细胞，且载体不会整合进入染色体DNA，另一个优势是可获得高病毒滴度（大于1011）；⑥腺病毒载体的缺陷是腺病毒基因表达产物引起免疫反应最终可能中和了感染的细胞，最终使得连续免疫产生的临床免疫效果不理想。现在复制缺陷性腺病毒已被应用于表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），口蹄疫病毒和牛疱疹病毒I型的保护性抗原基因。但腺病毒可在淋巴组织产生持续性感染，为了提高重组活载体病毒疫苗的安全性，研制出了宿主特异性禽腺病毒活载体苗。用禽腺病毒主要晚期启动子调控下的血清8型禽腺病毒表达VicS株IBVS1基因，对0或6日龄雏鸡口腔免疫且在35日龄攻毒，试验结果显示，接种后的第6天，对于IBV同源和异源毒株在支气管的保护率达到90％～100，细胞介导免疫对于同源和异源IBV毒株的保护是至关重要的。其产生交叉免疫保护反应的机制可能是通过特异表达IBVS1基因的重组腺病毒侵染黏膜组织，在盲肠扁桃体中初步复制，可能会诱导产生一种CTL反应导致交叉血清型保护，也可能是在支气管中诱导了抗S1的特异性IgA抗体。对于规模化养禽业来说，一次性免疫，廉价而有效的疫苗很重要，而且用腺病毒作载体表达IBV的保护性抗原作为活病毒载体疫苗代替弱毒苗，可减少新变异株的出现。3.3.3传染性支气管炎病毒载体随着分子生物学技术的不断发展，对IBV的基因组结构、复制转录调控机制有了更深入的了解，HackneyK等构建IBV感-5-染性分子克隆，用它作为RNA载体成功表达了异源免疫原基因、报告基因及γ干扰素，表明以IBVRNA为载体携带外源基因进行多病防治是可行的[23]。3.4重组细菌活载体疫苗重组细菌作为活载体运送疫苗，是近年来新的研究方向，其中主要有沙门氏菌和分枝杆菌。减毒沙门氏菌人工改造后因具有毒力低、黏附性好和侵袭性强，可经黏膜途径进行免疫，临床