非洲猪瘟病毒P72单克隆抗体的制备及抗体检测方法的建立.

非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体的制备及抗体检测方法的建立研究生：朱红导师：孙怀昌教授研究背景是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起猪的一种急性、热性、高致死性的传染病。强毒株感染的发病率和死亡率可达100%，OIE将其列为国际A类疾病。在非洲国家广泛流行。无有效疫苗进行防治。非洲猪瘟（Africanswinefever）研究背景形态特征（图1）复制方式：胞浆内分类：非洲猪瘟病毒科是唯一一种DNA虫媒病毒非洲猪瘟病毒（ASFV）下一页返回有囊膜、二十面体对称、双股DNA病毒；病毒粒子堆积于胞浆中，平均直径200nm,结构复杂。中心部为一个电子密度大的类核体，周围为清晰的六角形外壳。基因组约为170~210kb。研究背景研究背景VP72参与病毒吸附和进入细胞的四种主要蛋白之一。占病毒粒子蛋白的32%，是一种非常保守的抗原性蛋白,对自然感染具有免疫原性。是血清学检测的理想抗原。研究背景常规实验室诊断技术血吸附试验敏感猪接种试验PCR免疫荧光ELISA研究目的及意义诊断的意义目前尚无理想的疫苗对非洲猪瘟进行预防。抗体诊断的目的发病猪产生的IgG抗体在体内能持续很长时间，特别适用于亚急性和慢性病例的检出。单克隆抗体的优势特异性强高效，灵敏，便捷，成本低研究内容一非洲猪瘟病毒P72单抗的制备技术路线抗原的制备免疫BALB/c小鼠融合筛选鉴定免疫原的制备重组细菌pGEX-VP72表达融合蛋白GST-VP72免疫小鼠SDS-PAGE电泳定量IPTG诱导切胶、磨胶泳道1：pGEX-VP72未诱导全菌泳道2：pGEX-VP72诱导沉淀M：蛋白质预染Marker。↖↖免疫用蛋白表达鉴定KD12M1178549342519检测用抗原的制备重组细菌pGEX-VP72S表达GST-VP72S纯化GST-VP72S4℃或-20℃保存备用IPTG诱导GlutathioneSepharose4B方阵滴定法定量包被96孔反应板M：低分子量蛋白质marker1：未纯化的GST-VP72s2：纯化过的GST-VP72s97664331KDM12M：蛋白质预染Marker泳道1：未诱导的pGEX-VP72S泳道2：IPTG诱导的GST-VP72SM121178549342519KD←45←45检测用抗原的鉴定与纯化筛选结果筛选到五株阳性克隆，命名为3E9、3E11、4A8、4H2、6E5。方法GST-VP72sGST抗GST-VP72s阳性抗GST阳性包被96孔板√×{单克隆抗体的效价测定结论：细胞上清效价在27~212之间，腹水效价可达216。细胞株上清P/N值效价3E910.12123E115.7274A83.4274H26.7286E510.5212单克隆抗体的亚类鉴定细胞上清IgAIgG1IgG2aIgG2bIgG3IgM3E90.2030.2540.1411.20.2150.363E110.1700.2150.1770.8590.2840.4914A80.1940.2590.1980.9150.3050.3224H20.2320.3010.2420.950.2630.386E50.2170.3340.1742.2610.2620.352阴性对照0.2210.2220.2230.3060.2570.358结论：经亚类试剂盒鉴定，单抗的亚类为IgG2b。单克隆抗体的抗原识别间接ELISADot-ELISAWesternblotting方法间接ELISA结果GST-VP72s为抗原一抗OD值P/N3E91.55814.833E111.08510.334A81.21211.544H21.2039.526E51.34612.81阴性血清0.105GST为抗原一抗OD值P/N3E90.2941.4853E110.1490.7534A80.0670.3384H20.0640.3236E50.1370.692阴性血清0.198结论：与GST-VP72s抗原反应呈阳性，与GST抗原反应呈阴性。Dot-ELISA结果1~6：GST-VP72S为抗原，分别以3E9、3E11、4A8、4H2、6E5、阴性血清为一抗；7~12：GST为抗原，分别以3E9、3E11、4A8、4H2、6E5、阴性血清为一抗。结论：与GST-VP72S抗原反应呈阳性，与GST抗原反应呈阴性。123456789101112WesternblotM：低分子量蛋白质电泳marker1：抗原为复性的GST-VP722：抗原为纯化的GST3：抗原为纯化的GST-VP72sM123976643311410045KDiELISA抗体检测方法的建立研究内容二包被液PBS碳酸盐缓冲液(pH9.6)0.05MTris-cl(pH8.6)生理盐水蒸馏水OD值1.3081.2061.3671.4331.0310.7001.2681.2140.4200.520均值1.2571.4000.8651.2410.470抗原包被液的选择结论：以碳酸盐缓冲液（pH9.6）包被效果最好，其次是PBS和生理盐水，0.05MTris-cl(pH8.6)包被效果较差，蒸馏水包被效果不理想。00.20.40.60.811.21.41.6PBS碳酸盐缓冲液0.05MTris-Cl生理盐水蒸馏水包被液OD值封闭液包被条件10%小牛血清的PBST5%脱脂乳1%BSA阴性检测值P/N阴性检测值P/N阴性检测值P/N37℃2h0.2721.0213.750.1951.4677.50.5921.9983.374℃过夜0.2821.144.040.1981.5147.650.6352.3073.63抗原包被条件及封闭液的选择结论：4℃过夜包被要比37℃2h效果好，但是区别不是很大。三种封闭液中5%脱脂乳的封闭效果最好。012345678910%FCS+PBST5%脱脂乳1%BSA封闭液P/N37℃2h4℃过夜抗原最佳稀释度的测定单抗稀释倍数2526272829210211212213阴性1001.7651.7641.641.3241.180.8730.6660.490.3480.3512001.7251.5371.5781.2551.0740.840.6090.4530.230.3394001.711.5841.5391.2311.0620.8040.5480.3290.1190.3288001.6181.5611.5051.1671.0310.7560.5340.2910.1710.19816000.7571.491.3191.1640.9170.6270.40.170.1170.082结论：抗原最佳稀释度为1：256，单抗工作浓度为1：800，二抗工作浓度为1：1000。单抗稀释液的选择单抗稀释液PBSPBST检测值1.131.1221.1721.169均值1.1261.171结论：两种稀释液的效果相近，差别不大。冲洗液PBST（0.5%）PBST（0.1%）0.5MNaCl/PBST（0.5%）0.5MNaCl/PBST（0.1%）PBS检测值0.9690.8951.401.471.5511.451.5511.4311.2611.045均值0.9321.431.501.4911.153阴性值0.1390.120.1370.130.10.1030.1140.120.1910.188均值0.1290.1320.1020.1170.19P/N7.221114.712.746.06冲洗液的选择12345结论：以0.5MNaCl/PBST（0.5%）作为冲洗液灵敏性最强，PBS效果最差。0246810121416PBST(0.5%)PBST(0.1%)0.5MNaCl+PBST(0.5%)0.5MNaCl+PBST(0.1%)PBS冲洗液P/N值用纯化的VP72S抗原包被板子在同一条件下对猪瘟病毒，猪繁殖呼吸综合症病毒，猪无名高热病毒，猪圆环病毒，细小病毒等病毒感染血清以及正常猪血清，抗非洲猪瘟病毒阳性鼠血清，和模拟发病猪血清进行特异性交叉试验。CSFVPRRSV无名PCVPPV正常血清模拟血清阳性对照阴性对照检测值0.1110.0940.0880.0770.0730.1290.3751.3960.1050.0910.0850.080.0750.0760.0760.3951.9420.096均值0.1010.0890.0840.0760.0740.1030.3851.6690.101P/N1.000.880.830.750.731.023.8116.50结果——————++特异性交叉试验灵敏性试验模拟血清稀释倍数×50×100×200×400×800×1600阴性OD4901.8861.4631.0700.6780.4620.3090.065P/N2922.516.4610.467.14.7结论：模拟血清稀释到1600倍仍可以检测到阳性，说明该方法具有较高的灵敏性。抗原包被板保存期的测定第10天第20天第30天第40天第50天第60天OD4901.3391.3451.2081.1991.2671.259P/N8.37.98.27.87.87.6-20℃放置抗原包被板OD值和P/N的变化4℃放置抗原包被板OD值和P/N的变化第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天OD4901.4381.4451.3381.3391.351.4011.32P/N9.69.68.98.999.38.8结论：按此方法包被的酶标板在-20℃至少放置60天，在4℃至少放置7天。统计学t测验分析P=0.321≥0.05差异不显著统计学t测验分析P=0.190≥0.05差异不显著小结获得5株抗ASF-VP72阳性的杂交瘤细胞株腹水效价可达到216亚类鉴定为IgG2b建立了间接ELISA抗体检测方法4ug/ml的融合蛋白GST-VP72S作为包被抗原碳酸盐缓冲液为包被液，37℃包被2h作为包被条件5%脱脂乳作为封闭液，4℃封闭过夜作为封闭条件0.5MNaCl+PBST(0.5%Tween-20)为冲洗液单抗腹水的工作浓度为1：800，二抗工作浓度为1：1000该检测方法具有较高的特异性和灵敏性。THANKS！