植物基因工程育种

植物基因工程育种抗虫转基因植物抗病转基因植物其他抗逆转基因植物玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。转基因玉米利用转基因改良植物的品质转基因牵牛花我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛花的花色，使矮牵牛花的花色更加丰富多彩。世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年得以培植出来。转基因番茄1994年，美国政府批准了他们研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后，我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄，以满足人们的需求。转基因甜椒甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国科学工作者，采用转基因技术，培育出抗病毒的甜椒。转基因油菜油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40％左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。转基因小麦从植物体中分离出合成赖氨酸的基因，把这基因转入小麦植株中，培育出转基因小麦。用这种转基因小麦制造出来的面粉，更适合用来烤面包，而且面粉中赖氨酸含量高，这种面包的营养价值高。植物基因工程发展现状植物基因工程的概念•植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作，即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、遗传转化（根癌农杆菌Ti质粒介导法、基因枪法、原生质体介导法等），以及细胞、组织培养技术将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中，并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受体获得新性状的技术体系。转基因植物的应用前景和理论意义•通过将目的基因导入农作物、园艺、能源或其他经济植物中，改变它们的遗传特性，使植物免受病虫的危害，或获得抗除草剂的特性，或改变种子种淀粉、蛋白质的含量和组成、或改变花的形状和颜色，或改变植物的育性和不亲合性以及改变植物的抗逆性等。•转基因植物可作为一种生物反应器，生产药用蛋白和植物次生代谢产物，或生产某些有机化合物。•转基因植物为人们研究某一基因功能及其再生长发育中的作用提供了强有力的工具。国际转基因作物发展现状•在1996年2004年间，全球转基因植物的生产和利用超出了当初预料，基因作物主治面积增长了近48倍，从1996年的170万公顷增加到2004年的8100万公顷。再2004年全球转基因作物种植面积仍有66%在工业化国家，但发展中国家转基因作物的种植面积已逐年增加。国内转基因作物发展现状在某些领域达到了国际先进水平。2004年全国转基因作物种植面积为370万公顷，成为继美国、阿根廷、加拿大、巴西之后的转基因种植第五大国。迄今为迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。植物基因工程所用目的基因1.抗植物虫害基因2.抗植物病毒基因3.抗植物真菌病害基因4.抗植物细菌病害基因5.抗非生物胁迫基因6.提高作物产量、改良作物品质的基因7.改良植物其他性状和雄性不育的基因8.植物医药基因工程目的基因的分离与克隆方法1.基因芯片技术分离目的2.功能蛋白组技术分离目的基因3.定位克隆4.减法杂交5.mRNA差异显示技术6.利用PCR法获得基因，包括RT-PCR,锚定PCR,RACE等。7.人工合成短序列的目的基因目的基因表达载体的构建基因工程的载体系统1、质粒载体2、噬菌体载体3、病毒载体目的基因的转化方法■原生质体介导法■基因枪法■根癌农杆菌介导法一原生质体介导法概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外源ＤＮＡ直接导入植物细胞的方法。主要方法:1)PEG介导的基因转化2)脂质体（liposome)介导的基因转化3)电激法4)激光导入法5)显微注射法1PEG介导的基因转化原理：利用化学试剂，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(细胞促融剂)等，诱导原生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。案例：转基因烟草2脂质体介导基因转化原理：利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体,通过植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂质体转入受体细胞。特点：转化率高;操作繁琐;技术性高。3电激法介导基因转化原理：利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔“，形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA进入原生质体。特点：转化率高；操作简便；容易造成原生质体损伤。４显微注射介导的基因转化原理：利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核，从而实现外源基因的转移。优点：方法简单、转化率高；纯物理方法，适用于各种植物和材料，无局限性；对受体细胞无毒害，有利于转化细胞生长发育；培养过程无需特殊选择系统。５激光微束介导的基因转化原理：将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。优点：操作简便；工作效率高；无宿主限制，适应于各种动植物；对受体细胞生命活动影响小；受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化．6.花粉管导入法基因枪法（微弹轰击法）工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化。动力类型：火药爆炸力；高压气体；高压放电．操作步骤（1）制备DNA微弹；（2）准备靶外植体材料；（3）DNA微弹轰击；（4）培养轰击后的外植体．转化率影响因素•金属微粒金粉颗粒较钨粒性质优良,但是价格昂贵.•DNA沉淀辅助剂这些化合物对DNA在微粒上的黏附有重要作用,但对植物受体细胞也产生一定的伤害.•DNA纯度及浓度•微弹速度•植物材料内在因素根癌杆菌介导法•根癌农杆菌广泛亲染双子叶植物和裸子植物。根据根癌农杆菌诱导植物形成的根瘤中冠瘿碱的不同可将根癌农杆菌分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型3种类型。在根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒，简称Ti质粒。1Ti质粒的改造策略Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在着学多障碍：（1）质粒过大，造作困难（2）大型的Ti质粒有多个酶切位点（3）植物激素类的影响（4）Ti质粒中存在不起作用的序列（5）Ti质粒的局限性为了使Ti质粒变成操作简便且有效的外源基因转移载体,必须对野生型的Ti质粒进行改造.植物转基因有一元载体系统和二元载体系统,所以采取不同的改造策略.二元载体较一元载体的优点:1)构建比较方便;2)二元载体不会带入大量的无用的多余的DNA序列.因为一元载体的T-DNA区中含中间载体,他们会随同外源基因一起被转入植物细胞中.2根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理6个步骤：1）农杆菌对受体的影响（2）农杆菌附着到植物受体细胞（3）诱导启动毒性区基因表达（4）类似接合孔复合体的合成和装配（5）T-DNA的加工和转运（6）T-DNA的整合•3。T-DNA转移的影响因素（1）农杆菌菌株（2）农杆菌菌株高侵染活力的生长时期（3）基因活化的诱导物（4）外植体的类型和生理状态（5）外植体的预培养（6）外植体的接种及共培养基因枪法与根癌农杆菌介导发的比较(1)基因枪法——多拷贝整合概率高，外源基因默表达。农杆菌介导——低拷贝整合（多为单拷贝整合）转化效率较高。(2）基因枪法——纯物理转化，不存在物种的限制。农杆菌介导——存在宿主范围的局限性。（3）基因枪法适于以细胞器为转化目标的转基因研究。转基因操作的受体系统1、高频再生体系的建立•愈伤组织再生系统•直接分化再生系统•原生质体再生系统•胚状体再生系统•生殖细胞再生系统2、抗生素敏感实验抑制细菌生长杀死非转化细胞3、农杆菌敏感实验转化细胞的培养和转基因植株的再生•恢复生长•筛选培养•植株再生转化子细胞的筛选•当采用某种转基因方法处理外植体后，通常外植体中仅仅只有几个少数细胞获得转化，只有采取有效的转化方法，才能提高准确地选择到转化细胞。一般情况下，转化载体上除了带有目的基因外，大多还携带选择基因，以供转化细胞筛选使用。转化筛选细胞的方法主要有两种：一是根据选择基因的特点在筛选选择培养基中加入能抑制非转化细胞生长的有毒物质（如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以解除培养基中有害物质对细胞生长的抑制作用，这样只有转化细胞才能生长繁殖；另一种方式是，受体细胞为营养缺陷型细胞，在选择性培养基中不能生殖，而选择培养基可以补偿这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。转基因植物的鉴定1.遗传鉴定2.表达鉴定3.表型分析鉴定利用报告基因Northern杂交Western杂交直接鉴定DNA分子是否整合到基因组上。1）扩增目的片段；2）杂交信号鉴定。（Southern杂交）鉴定步骤：筛选鉴定（利用质粒上的选择标记）报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因）遗传鉴定生长试验DNA鉴定-southernRNA鉴定-northern蛋白质鉴定-western一、植物基因工程中的选择基因•植物基因工程中的基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。最常用的有新霉素抗性基因（neor）、庆大霉素抗性基因（gentr）、潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）,以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等。•1、新霉素抗性基因（neor）新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的，其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418。卡那霉素、新霉素可通过与核糖体小亚基结合抑制蛋白质的合成，G418可通过抑制80S核糖体的功能而阻断真核细胞中的蛋白质合成。新霉素抗性基因可使选择试剂磷酸化而失效。2.庆大霉素抗性基因（gentr）•该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因，它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。该选择系统目前也有一定的应用，例如矮牛、烟草和番茄。3.潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都有很强的毒性。潮霉素林酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使其失活。4.膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对应的选择试剂为膦丝菌素（basta）,膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积。二、报告基因•报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是够成功地导入体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。它应用不依赖于外界选择压力的存在，这一点也是它与选择基因的区别之处。•理想报告基因的基本要求：1、受体细胞不粗在相应的内源等位基因的活性。2、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。3、具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。•目前最常用的报告基因有：•ß-葡萄糖苷酸酶基因（gus）•氯霉素乙酰转移酶基因•3.荧光素酶基因ß-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因编码ß-葡萄糖苷酸酶,存在于某些细菌体内，该酶是一种水解酶，能催化许多ß-葡萄糖苷酸类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的GUS活性，许多细菌及真菌也缺乏内源GUS活性，因而gus基因被广泛应用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用最多。氯霉素乙酰转移酶基因•该基因来自大肠杆菌转座子Tn9，它