重组干扰素

重组干扰素Alick和Jean发现干扰素病毒感染的细胞能产生一种因子作用于其他细胞并干扰病毒的复制。1957什么是干扰素(retrievedonJanuary3,2016)PassageDownloadedfrom发现干扰素抗病毒的作用机制抑制病毒的信使RNA功能1966-1971干扰素的作用机制FinlayMcNab,KatrinMayer-Barber,AlanSher,AndreasWackandAnneO’Garra“TypeIinterferonsininfectiousdisease”.Naturereviews.Immunology:87–103.2015,2脊椎动物感染病毒体细胞干扰素细胞因子IFN激活ISGs(interferonstimulatedgenes)相邻细胞及受感染细胞•抗病毒蛋白免疫细胞•使细胞裂解•抗病毒抗体干扰素用于临床用纯化的人白细胞干扰素成功治疗2例慢性乙肝患者，但是由于人白细胞干扰素原材料来源有限，未能大量应用于临床。1976关于乙肝张焜和,乙肝病毒感染的基础与临床,江西科学技术出版社,1999年07月第1版,第34页高翔.乙肝病毒携带者健康歧视的法律规制研究[D].福建:华侨大学,2007.嗜肝DNA病毒：HBV•本身无毒害：慢性发作：我国1.2亿乙肝病毒携带者•顽强生命力•引起免疫反应→损坏肝脏干扰素治疗乙肝：•抗病毒作用•免疫调节作用•抗纤维化作用干扰素的分类及应用干扰素I型干扰素IFN-αIFN-βIFN-κIFN-ωII型干扰素IFN-γIII型干扰素IL10R2IFNLR1(retrievedonJanuary3,2016)主要适应症：几乎能够抵抗所有病毒引起的感染目前主要用于乙肝、丙肝的治疗获得重组干扰素科学家们用基因工程技术在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了重组人干扰素。1980资金来源多样化19991986~20021996~200220031989体外诱生制备:Sendai诱导人白细胞人源转化细胞系培养:多亚型混合干扰素基因工程E.Coli发酵:重组人干扰素工程CHO细胞系构建动物无限细胞系培养假单胞杆菌工程菌发酵IFNα-n3批准上市工艺复杂产量低:1g=3亿ml来源困难价格昂贵潜在血源性病毒污染IFNα-n1/Wellferon首次实现大规模商业化生产活性低退出临床应用无糖基化无N-met无活性包涵体166aa糖基化蛋白22.5ku分泌表达产量低成本高过程严格IFNα-2b/Alferon安福隆无糖基化可溶性蛋白具有天然分子结构具有生物活性生产工艺的发展甘乐能上市世界上第一个重组人干扰素IFN-2b—IntronA由美国ScheringPlough公司上市，被FDA批准于治疗慢性乙肝。1986甘乐能适应症:本品用于慢性乙型肝炎，慢性丙型肝炎，肾细胞癌，恶性黑色素瘤等疾病的治疗。用法用量：皮下注射。不良反应：常见为发热、疲乏、头痛和肌痛。禁忌：对重组干扰素α-2b及其所含组分有过敏史的患者禁用。禁止使用本品和利巴韦林联合治疗。注意事项：本品含稳定剂间-苯甲酚，某些患者可对此发生过敏反应。详见说明书。一个重组干扰素的典型事例AspecificexampleofrecombinantIFN生产工艺制剂研究给药方式市场分析研究进展重组人干扰素生产工艺基因工程假单胞杆菌的构建与保藏干扰素的发酵工艺过程干扰素的分离纯化工艺过程产工艺构建与保藏发酵分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库干扰素α-2b基因的克隆表达载体的构建工程菌的构建制备白细胞病毒诱导分离mRNA反转录酶合成cDNA、PCRATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCACACGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACCTCTACTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGA参考文献：孔晓清，张忆疆.假单孢杆菌发酵生产α-2b干扰素工艺,2010构建与保藏发酵分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库干扰素α-2b基因的克隆表达载体的构建工程菌的构建IFN基因连接质粒转化E.coli筛选鉴定阳性克隆测序：人IFNα-2b基因序列，501bp，165aapVG3参考文献：元英进，制药工艺学，2007，P223构建与保藏发酵分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库干扰素α-2b基因的克隆表达载体的构建工程菌的构建转化腐生型假单胞杆菌筛选高表达、稳定遗传的工程菌获得原始菌种参考文献：元英进，制药工艺学，2007，P223构建与保藏发酵分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库具有宿主菌的特征：细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。菌落：直径2.5-3.0mm，灰绿色半透明状，粘稠。生化特性：Ser—，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为碳源。工程菌的特征：SmR、TcR、ApR具有生产干扰素能力构建与保藏发酵分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库加入甘油原始菌种传代扩增冻干保藏QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性菌种检查合格后，方可投产。构建与保藏发酵分离纯化菌种建立菌种特性菌种库工作菌种库主菌种库或上一代工作菌种库OD值8.0种子罐培养摇瓶种子培养培养基Ependorf管OD值5.5离心构建与保藏发酵分离纯化发酵过程发酵控制生产菌种摇瓶培养活化种子罐培养放大发酵罐培养菌体收集发酵液降温发酵液离心菌体冷冻保存配制培养基蒸汽灭菌原料构建与保藏发酵分离纯化发酵过程发酵控制发酵条件控制菌体生长与干扰素合成关系1.5-3h生长最快，干扰素合成在3.5h后，4h最大培养基组成种子培养基：C/N低发酵培养基：C/N高pH控制：加入缓冲体系DO控制高时，产物明显提高；质粒的稳定性提高策略：加大转速，增加通气量，必要时用纯氧温度前期控制在30℃，保证菌体快速生长后期控制在20℃积累产物，同时防止产物降解PH值菌体生长：pH6.8产物积累：pH6.0策略：两段培养泡沫控制机械除泡和消泡剂共同使用构建与保藏发酵分离纯化分离工艺纯化工艺溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装检测菌体裂解预处理初级分离构建与保藏发酵分离纯化分离工艺纯化工艺溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装检测菌体裂解预处理初级分离制剂研究和给药方式干扰素注射制剂鼻腔内给药系统长效干扰素制剂产工艺024487296120144168192时间(小时)干扰素浓度•半衰期平均4小时1•血清干扰素浓度为零1•病毒重新出现2降低肾脏排泄避免酶水解避免免疫细胞清除普通干扰素聚乙二醇化干扰素WHYPEGXuZX,etal.Hepatology.1998;28(suppl):702A.LamN,etal.Hepatology.1997;26:226–31.PEG分子量半衰期抗病毒活性高(长)低(短)30KD30KD5KD5KD12KD延长半衰期与保留活性之间的最佳平衡WHY12KD佩乐能1989-1999年，多亚型人天然干扰素混合物——IFNα-N3和IFNα-N1获批上市。由于人天然干扰素因其产量低、活性低且具有潜在的血源性病毒污染等特点而逐渐退出市场。1987年，Amgen公司生产的复合干扰素产品Infergen（重组集成干扰素α注射液）获批上市，主要用于成年患者的慢性丙型肝炎治疗，不过其市场表现平平。1990年，InterMune公司上市了第一个rhIFN-γ产品Actimmune，用于慢性肉芽肿病，重度恶性骨骼石化症等疾病的治疗。1993年，Bayer公司上市第一个rhIFN-β1b产品Betaseron，用于多发性硬化症（MS）的治疗。2001年，FDA批准ScheringPlough公司的长效干扰素——聚乙二醇IFN-α2b，使得给药频率减少为1周1次。2014年7月和8月，BiogenIdec公司的长效IFN-β1a产品Plegridy（聚乙二醇干扰素β-1a）获欧盟和FDA批准上市，用于治疗成人多发性硬化症（MS），其剂量为每两周一次。市场分析和研究进展第二大重组蛋白五巨头垄断全球市场新型竞争药物冲击疾病谱差异国内新药进展产工艺资料来源：FDA招商证券第二大重组蛋白干扰素长效rh-IFN短效rh-IFNBiogenIdec公司：Avonex（IFN-β1a）MerckSerono公司：Rebif（IFN-β1a）Bayer公司：Betaferon/Betaseron（IFN-β1b）Novartis公司：Extavia（IFN-β1b）Roche公司：Pegasys（PEGIFN-α2a）美国MSD公司：Peg-Intron（PEGIFN-α2b）近期获批：Plegridy（聚乙二醇干扰素β-1a）第二大重组蛋白2003-2013年重组干扰素在全球的销售额由45.1亿美元增加到91.5亿美元仅次于重组人胰岛素，为全球第二大重组蛋白药物，年复合增长率为7.33%。五巨头垄断全球干扰素市场全球销售额为91.5亿美元:BiogenIdecMerckSeronoBayerRocheMSD2013年，前五大公司占据约98%市场份额，从产品的分类看：β干扰素占据约79%份额，α干扰素占据约21%。受新型竞争药物冲击两支长效α干扰素成为丙肝和乙肝的一线用药。近年来，新的核苷类似物口服药物已占据乙肝用药主流，以Sovaldi为代表的突破性疗法的口服新药正在改变丙肝的治疗习惯。β干扰素在MS治疗地位的产品。普通β干扰素的升级Plegridy（聚乙二醇干扰素β-1a）获批上市，有望成为β干扰素市场重要推动力。疾病谱差异导致国外IFN-β国内IFN-α全球干扰素市场中以复发型多发性硬化症为主要适应症的IFN-β的市场占比逐年提高，而作为抗肝炎病毒的IFN-α的市场份额却在逐年萎缩。如图6所示，国内基本以IFN-α为主。疾病谱差异导致国外IFN-β国内IFN-α•全球大约有250万人受MS的困扰。欧美发病率较高，中国发病率较低。•欧美乙肝和丙肝感染人数较低，中国拥有全球数量最多的乙肝和丙肝患者，导致国内外干扰素产品结构差异较大。国内干扰素新药的研发情况在长效干扰素α这一领域中，通化东宝的子公司厦门特宝公司的产品进展速度最快，已于14年1月向国家药监局申请生产；另外安科生物的长效干扰素α新药也于14年6月获批临床试验，双鹭药业于14年4月申请临床试验。在干扰素β领域，目前还只有海正药业一家企业在开展新药研发工作，并于13年6月申请临床试验。取保存工作种子批菌种，室温融化摇瓶活化培养：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h检测：OD值和发酵液杂菌检查。1）摇瓶培养干扰素生产工艺发酵工艺过程接种：接入30L种子罐，接种量10%