钩端螺旋体属微生物学检验

钩端螺旋体属微生物学检验(一)检验程序钩端螺旋体检验程序见图21-3。(二)标本采集钩端螺旋体可从临床标本和自然界的水中分离获得。临床标本主要包括血液、尿液、脑脊液和房水。发病早期(1周内)取血液；2周后取尿液；有脑膜刺激者取脑脊液；有眼部并发症者可取眼房水；用于钩端螺旋体的病原学检查。(三)直接显微镜检查将标本行差速离心集菌后作暗视野显微镜检查，或用Fontana镀银法染色后镜检。如发病早期的病人抗凝血，先1000r／min离心10分钟，除去红细胞，血浆再以10000r/min离心40分钟，弃上清，取沉淀物镜检。此法对早期快速诊断有一定价值，但敏感性低，缺乏特异性且不能获得菌株及测知菌群类型，需要其他方法补其不足。也可用免疫荧光法或免疫酶染色法检查，以提高特异性和敏感性。(四)分离培养和鉴定将每份血液标本接种2～3管Korthof培养基28℃培养。多数阳性标本在l～2周内可见培养液呈轻度混浊，以暗视野显微镜检查有无钩端螺旋体存在。菪有钩体，则用已知诊断血清鉴定其血清群和血清型。分离培养应连续观察30天以上，仍无生氏者方可确定为阴性。尿液标本一般需离心后取沉渣接种2～4管Korthof、培养基，且培养基中需加抑菌剂(5-氟尿嘧啶)。动物接种是分离钩端螺旋体的敏感方法。将标本接种于幼龄豚鼠或金地鼠腹腔，接种3～5天后，可用暗视野显微镜检查腹腔液i亦可接种后3～6天取心脏血镜检和分离培养。动物死后解剖，可见皮下、肺部等有大小不等的出血斑，在肝、脾等脏器中有大量钩端螺旋体。(五)血清学诊断采集病程早、晚期双份血清，一般在病初和发病后第3～4周各采一次。有脑膜刺激症状者采取脑脊液检测特异抗体。目前常用显微镜凝集试验(MAT)检测血清中的钩端螺旋体抗体。MAT是用标准株或当地常见菌株作抗原，分别与患者不同稀释度的血清混合，30℃作用2小时，滴片用暗视野显微镜检查。若待检血清中有某型抗体存在，则在同型抗原孔中可见钩端螺旋体凝集成团，形如小蜘蛛，一般患者凝集效价在1：400以上或双份血清效价增高4倍以上有诊断意义。间接凝集试验、补体结合试验、间接免疫荧光试验和ELISA等血清学方法也可用于诊断。(六)分子生物学检测用PCR技术、同位素或生物素标记的DNA探针技术检测钩端螺旋体，较培养法快速、敏感。此外，限制性内切酶指纹图谱可用于钩端螺旋体的菌株鉴定、分型以及抗原变异研究。