酵母核糖核酸的分离

实验6酵母核糖核酸的分离及组分鉴定5’5’3’3’一、实验目的掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%~10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%~0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。二、实验原理RNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，加钼酸铵沉淀（或用定磷法）和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。（1）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。（2）地衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。（3）磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀[(NH4)3PO4·12MoO3↓]。二、实验原理三、仪器、原料和试剂仪器：试管；试管架；100mL氢氧化钠烧杯；移液管0.2mL（×1）、2.0mL（×2）、1mL（×2）；量筒10mL、50mL各一个；滴管；水浴锅；离心机；布氏漏斗。原料：干酵母粉三、仪器、原料和试剂试剂：（1）0.2%氢氧化钠溶液；（2）95%乙醇；（3）乙酸、乙醚；（4）10%硫酸；（5）0.1mol/L硝酸银溶液；（6）1mol/L浓氨水；（7）酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mLHCl；（8）三氯化铁-浓盐酸溶液：将2mL10％三氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液加入400mL浓HCl中；（9）地衣酚-乙醇溶液：称取6g地衣酚溶于100mL95％乙醇；（10）钼酸铵试剂：将2g钼酸铵溶解在100mL10%硫酸中。四、实验步骤1、酵母RNA的提取称4g干酵母粉悬浮于40mL0.2%NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入100mL烧杯中沸水浴加热30分钟，不断搅拌。冷却，3000r/min离心10-15分钟后，将上清液慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅。加毕，静置，待RNA完全沉淀，3000r/min离心3min。弃去上清，用95%乙醇洗涤沉淀两次（每次约10ml），继而用无水乙醚洗两次（每次10ml），洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量。2．RNA组分鉴定水解RNA：取0.5~1g提取的核酸，加入10%硫酸10mL沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。（1）嘌呤碱：取一支试管，加入1mL水解液，加入过量浓氨水（约2mL）。然后加入1mL0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。（2）核糖：取一支试管，加入水解液1mL，三氯化铁浓盐酸溶液2mL和地衣酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。（3）磷酸：取一支试管，加入2mL水解液，然后加入5滴硝酸银和1mL钼酸铵溶液后，在沸水浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀。五、计算RNA提取率（%）=RNA质量（g）/干酵母粉质量（g）×100%六、注意事项稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。利用等电点控制RNA析出时，应严格控制pH。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因此地衣酚实验不能作为RNA与DNA鉴别的依据。七、思考题1、如何得到高产量RNA的粗制品？2、现有三瓶未知溶液，已知它们分别为蛋白质、糖和RNA，采用什么试剂和方法鉴定？（自行设计简便的实验）