酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究

酿酒酵母中提高乙醇产量的工程拓扑结构和蔗糖代谢动力学的研究1简介酿酒酵母主要以两种方式代谢蔗糖。在第一种也是占主导地位的代谢中，蔗糖被SUC2基因编码的胞外转化酶水解,水解产生的葡萄糖和果糖通过由HXT基因家族的成员编码的己糖转运子的协助扩散进入细胞。在第二种代谢中，蔗糖通过质子同向运输机制进入细胞并在胞内水解。胞内和胞外的转化酶都是由同一基因（SUC2）编码的。1、研究从胞外空间到胞内蔗糖水解的重新定位能否用于提高蔗糖的乙醇产量；2、对于只能利用胞内转化酶的菌株，是否有其他步骤提高其的蔗糖利用率。2材料与方法2.1酵母菌株及保养用于该研究的酿酒酵母菌株是CEN.PK族的同源体系。2.2菌株构建参考菌株CEN.PK113-7D(SUC2)改良iSUC2菌株IMI056、IMM007、IMM008、IMM009。2.3培养基和培养预培养：含有100ml合成培养基的500ml摇瓶置于200rpm的Innova震荡培养箱中培养。50%的蔗糖溶液在转移到培养基之前通过过滤灭菌。厌氧培养的培养基需添加溶于乙醇的麦角甾醇（10mg/l）和吐温80（420mg/l）。在800rpm、30℃的2L实验室生物反应器中进行厌氧恒化发酵。有效容积用电子传感器和废水泵保持在1.0L。pH通过自动添加2M的KOH保持在5.0。培养过程中以500ml/min喷入氮气（10ppm氧气）。在生物反应器中，使用氯化橡胶的管子和氟橡胶O型圈，培养器皿用氮气冲洗。2.4分析方法将液体培养基离心处理后获得上清液、残留的糖分上清液和培养基通过HPLC分析，HPLC用的是60℃、5mMH2SO4作为流动相，流速为0.6ml/min的AminexHPX-87H离子交换柱。乙醇、甘油、琥珀酸盐和乳酸盐由Waters2410相差检测仪检测。丙酮酸和醋酸盐是由Waters2487紫外检测仪214nm处检测得到蒸发得到乙醇浓缩物。2.5转化酶试验在恒化器中选出细胞，冲洗两次，在冷水中重新悬浮。胞外转化酶活性由葡萄糖发酵测得。在30℃、含有150mM蔗糖、50mM氟化钠50mMTris-丁二酸缓冲(pH5.0)中进行细胞孵育的。为测转化酶总活力，细胞用乙醇、10%TritonX-100和甲苯(1:4:1)渗透，冲洗两次，并在30℃、含100mM蔗糖的50mMTris-丁二酸缓冲(pH5.0)中孵育。所有试验一式三份，确保标准误差10%2.6蔗糖质子转运试验蔗糖吸收中质子的转运取决于酵母悬浮液中对pH变化的记录。酵母细胞悬浮在细胞浓度为25g/l的K-邻苯二甲酸酯缓冲液（pH5.0）中，并存放在总体积为5ml的水夹套容器中。悬浮物在30℃下由磁力搅拌器混合。蔗糖引起的pH变化由pH传感器监控。为了计算质子吸收率，用100-500nmol的NaOH细胞悬浮液做一标准曲线。蔗糖引起的最初的质子吸收率由蔗糖添加后的第一个10-20s的斜率减去蔗糖添加前的质子吸收率。所有的实验一式三份，确保标准误差15%。2.7微列阵处理和分析DNA芯片分析采用S98酵母基因芯片阵列法，细胞直接从恒化器中转移到液氮中，通过15ug完整RNA与一个环cDNA综合体试剂盒的组成成分就能合成一个双股cDNA综合体。在试管转录之前利用基因芯片样品清理模块纯化双链cDNA，并标明是基因芯片IVT标记试剂盒。最后，在15ug生物酰化的cRNA分裂和杂交之前用基因芯片样品净化模块纯化标记的cRNA。阵列图像和过滤数据的采集和定量是由Affymetrix基因芯片操作系统软件（1.2版）来完成的。添加在MicrosoftExce中的微阵列显着性分析（SAM）2.23A版本用于比较在蔗糖限制条件下IMI056和IMM007复制阵列实验。3.1蔗糖代谢的拓扑学：影响生物量和乙醇产量的理论分析只采用胞内水解途径的菌株的乙醇产量的增加与采用胞外途径的菌株的产量有以下关系（1）YSucE，intra=0.75YSucE，extra+0.25YSucE，max（2）R=0.75+1/YSucE，extra其中R=YSucE，intra/YSucE，extra在参考菌株CEN.PK113-7D的厌氧蔗糖限制性恒化培养中，蔗糖的乙醇产量为2.96mol/mol。假设该菌株的胞内蔗糖水解作用可忽略，则乙醇产量与YSucE，extra一致。这表明胞内水解作用的转变可使乙醇产量提高8.7%。3.2SUC2基因工程引起胞液中转化酶的重定位在工程菌株‘iSUC2’IMI056和参考菌株CEN.PK113-7D(SUC2)中转化酶的定位是通过比较总的和胞外的蔗糖水解活性来分析的。在对照菌株中90%的总转化酶活性来自于胞外，在iSUC2中94%的转化酶活性来自于胞内（表3）。iSUC2菌株的总转化酶活性比对照菌株的高，可能是由于表达iSUC2基因的ADH1启动子的应用。在iSUC2菌株IMI056中发现在胞外有低的转化酶活性（表3），可能是因为一些胞内转化酶的释放或是其他未知的低活性的胞外蔗糖水解酶。6%90%蔗糖跨膜转运的最适动力学阻碍蔗糖胞内水解代谢一些胞内转化酶的释放或是其他未知的低活性的胞外蔗糖水解酶3.3转化酶的胞质表达对生长化学计量学的轻微影响iSUC2菌株的生物产量只比SUC2对照菌株低6±2%（表3）。这个差异远小于胞内蔗糖完全水解​​时预测的25%的差异。与两种菌株的生物产量的微小差异相一致，工程菌的乙醇产量只有一个微小的增加（表3）。工程菌IMI056(1.8g/l)的恒化培养中蔗糖的残余浓度比对照菌株CEN.PK113-7D(0.1g/l)的要高很多。这表明蔗糖跨膜转运的最适动力学阻止了高效的蔗糖胞内水解代谢。3.4提高蔗糖转运量和乙醇产量的恒化培养实验室进展提高一个数量级从2g/l降低到大约0.1g/l3.5AGT1对提高改良iSUC2菌株的蔗糖转运动力学上的重要作用为研究AGT1在提高蔗糖质子转运动力学方面所设计的因素，改良iSUC2菌株IMM007中敲出AGT1。转运体在改良菌株中仍表现出一半的蔗糖质子转运量，该转运体正确整合了AGT1基因转座子。染色体DNA的诊断PCR扩增显示出改良iSUC2菌株中所有的AGT1重复片段，去除改良iSUC2菌株中所有的AGT1重复片段时，它的蔗糖质子转运能力迅速下降。在胞内蔗糖水解作用和有效地蔗糖发酵中Agt1p蔗糖转运体的存在4讨论蔗糖转运动力学的提高也可以由AGT1有针对性的过度表达或由基因编码蔗糖质子转运体来实现在改良iSUC2菌株中乙醇产量的明显增加与理论预测是一致的（9%）。在工业生产中实现用iSUC2提高产量，主要取决于比增长速率和生物量。