霍乱弧菌检验操作规程

1霍乱弧菌检验操作规程1范围本操作规程规定了带菌者粪便，患者粪便、呕吐物、肛拭子，外环境水样，水生动物、食品等标本中的霍乱弧菌的检验方法。2检验依据国家传染病诊断标准：WS289—2008卫生部疾病控制司《霍乱防治手册》第五版北京市卫生防疫站《卫生防疫微生物检验操作规程》《北京市常见传染病防制工作手册》（北京市疾病预防控制中心传地所2008年12月内部资料）3设备和材料3.1冰箱：-20℃～4℃。3.2恒温培养箱：36±1℃。3.3暗视野显微镜：10×～100×。3.4架盘药物天平：0g～500g,精确至0.5g。3.5锥形瓶：100mL、500mL。3.6灭菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。3.7灭菌平皿：直径90mm。3.8灭菌试管：10mm×75mm、16mm×160mm.。3.9灭菌注射器：1mL。3.10载玻片。3.11盖玻片。3.12无菌棉签。3.13500mL灭菌采样瓶。3.14生物安全柜：Ⅱ级。4培养基和试剂4.1碱性蛋白胨水（Ph8.8-9.0，10—15mL/管，10×50mL/瓶）。4.2庆大霉素琼脂（15-20mL/块）。4.3普通营养琼脂（15-20mL/块）。4.4半固体培养基（3mL/小管，5mL/中管）。4.5霍乱弧菌单克隆抗体(国家CDC流研所提供，5—10μL/菌落)。4.6泰国S＆A诊断血清（5—10μL/菌落)。25检验程序霍乱弧菌检验程序见图1。6标本的收集与送检要求见表标准与要求（一）—（四）7操作步骤7.1快速辅助诊断：其结果只是初步报告，不是确诊报告。7.1.1动力及动力抑制试验：7.1.1.1如是急性期病人的水样便，则用接种环或滴管取1滴水样便在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力；或加生理盐水1滴在玻片上，用接种环取较干的便1环放置生理盐水中研匀，盖上盖玻片直接用暗视野显微镜观察动力；高度可疑的标本可取已增菌的碱性蛋白胨水1滴在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力。如在镜下见到穿梭样运动（象夜空中的流星）即动力试验阳性，否则阴性。7.1.1.2动力试验阳性的标本，则取O1和O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体各2滴放置玻片上，取标本1滴或1环放在其中研匀，盖上盖玻片，用暗视野显微镜观察是否有原来的穿梭样运动，如穿梭样运动已迅速停止并凝集成块状即动力抑制试验阳性，否则阴性。7.1.1.3动力试验和动力抑制试验结果可口头初步报告，但不是确诊报告。双阳时口头报告高度可疑。7.2分离培养7.2.1粪便、呕吐物和肛拭子：对急性期病人水样便标本在碱性蛋白胨水增菌培养的同时可用接种环取一满环或用棉拭子直接接种在庆大霉素琼脂培养基上；所有病人标本都应接种碱性蛋白胨水增菌培养。37℃增菌6～8h后，从菌膜下表层取一接种环培养物，把接种环在试管壁上轻轻碰一下，待接种环上留有残液后划线接种庆大霉素琼脂培养基，划线时接种环在基线处反复多次划线以接种的菌液干了为准，最后用接种环从基线处开始不间断划线到完成或四区划线（必须划出单个菌落）。37℃培养，18h-24h。必要时（高度可疑或密接服药的病人）可取第一次增菌液1mL转种于8-10mL碱性胨水管中37℃二次增菌培养6～8h后做分离。7.2.2水样：十倍浓缩碱胨水增菌培养法水体的采集一般用无菌的500mL水样瓶采集相对静止的表层水(深度为30cm以内)500mL，2～3小时内送检。取450mL水样，用1mol/L氢氧化钠调整至pH8.8-9.0。然后加10倍浓缩碱性胨水50mL。为抑制杂菌可再加入1%亚碲酸钾0.25mL和1000单位/mL青霉素1mL。37℃培养过夜划线接种庆大霉素琼脂培养基，接种划线方法同7.2.1。培养时把瓶盖打开三分之一。培养后取菌膜下表层培养物0.2-0.3mL接转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h，再划线接种庆大霉素琼脂培养基，37℃培养18-24h。接种划线方法同7.2.1。7.2.3食品及水产品样本：7.2.3.1液体食品：同7.2.27.2.3.2涂抹标本：使用无菌棉签涂抹3～5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔或食品等表面，直接接种到10mL碱性蛋白胨水，37℃增菌培养8～12h划线培养。同时取菌膜下表层培养物接种庆大培养基分离培养同时吸0.2～0.1mL转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养8～12h再划线接种庆大霉素琼脂培养基，37℃培养18-24h。接种划线方3图1病人粪便标本水样、液体食品等标本食品及水产品、物品表面涂抹涂样本表面涂拭物动力试验（+）动力抑制试验（+）增菌３７℃6-8h二次增菌３７℃6-8h增菌３７℃过夜培养二次增菌３７℃6-8h增菌３７℃8-12h二次增菌３７℃8-12h庆大平皿划线培养３７℃18-24h每皿挑取9-10个可疑菌落血清凝集试验口头报告高度可疑霍乱分群诊断（单克隆抗体）Ｏ１群Ｏ１３９群霍乱分型诊断分纯（普通琼脂）３７℃18-24h凝集和氧化酶试验阳性：确诊报告半固体琼脂３７℃18-24h分纯（普通琼脂）上送菌种PCR（测CT）4法同7.2.1。7.2.3.3固体食品：25-50克标本放入碱性胨水中增菌培养同7.2.3.2。标本与碱性胨水的比例为1：5。7.3可疑菌落：每一庆大霉素琼脂平板上各挑取9-10个少于9个的全部挑取)可疑菌落做玻片凝集试验进行鉴定。可疑菌落的形态：略带青灰色、半透明、扁平、微隆起、光滑湿润。如延长培养时间或室温放置到48h，菌落略带黄色，中心形成黑色金属碲沉淀。7.4鉴定分型7.4.1玻片凝集试验7.4.1.101、0139群霍乱弧菌初步鉴定：挑取可疑菌落与01群、0139霍乱弧菌单克隆抗体做玻片凝集试验。如可疑菌落很快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝集颗粒，在生理盐水中不凝集者判为阳性。均为阴性时方可报告：未检出01、0139群霍乱弧菌。7.4.1.2分纯：用接种环取抗原抗体复合物接种于普通营养琼脂板上分纯，37℃过夜培养。7.4.1.2复核及分型：挑取可疑菌落和纯培养物进行复核及分型。01、0139群霍乱弧菌用诊断血清和单克隆抗体复核。01群霍乱弧菌分型使用小川型及稻叶型的单价血清和单克隆抗体做玻片凝集反应，同时用生理盐水做对照。与小川型单价血清和单克隆抗体凝集，与稻叶型单价血清和单克隆抗体不凝集者为小川型。与小川型单价血清和单克隆抗体不凝集，与稻叶型单价血清和单克隆抗体凝集者为稻叶型。与小川型、稻叶型单价血清和单克隆抗体均呈明显凝集者为彦岛型。7.4.2氧化酶试验和菌种保存：取纯单个菌与相应的血清和单克隆抗体进一步验证鉴定的结果，如凝集阳性者做氧化酶试验。氧化酶试验时应注意不要用过期试剂和金属铁质的接种针（环），操作见WS289—2008附录A（A.4.1.2）。氧化酶试验阳性者保存菌种：用接种环取单个菌落穿刺半固体培养基中，底部1/3以下不必穿刺。37℃过夜培养，换胶塞密封室温保存。7.4.3PCR检测霍乱毒素基因，见WS289—2008附录B。7.4.4菌种上送：半固体一支；纯培养普通琼脂一块；填写统一的送检单。8质量控制8．1用接种环取完标本、诊断血清、做完每一份标本实验等，接种环应严格在酒精灯火焰上消毒，避免交叉污染。8．2玻片凝集试验阳性时，一定同时做生理盐水对照。在生理盐水中不凝集者，方可判断为阳性。8．3标本、增菌管、培养平皿要严格编号，标识清晰，避免结果错报。8．4诊断血清、培养基保存在指定温度范围内；诊断血清要在有效期内使用，培养基保存不超过一个月。9实验室生物安全9．1标本检测要穿实验专用服、戴口罩、手套，用过的口罩、手套放黄色污物袋中，及时高压处理。9．2用过的玻片及时放入消毒缸中浸泡；实验完毕，用浸泡消毒液的抹布擦拭实验台面，或紫外线照射消毒。9．3消毒制品要有有效的批准文号，在有效期内使用。配制的消毒使用液，要表明配制日期。9．4标本、培养物、实验废弃物等，要经高压消毒处理后，方可丢弃。5标准与要求（一）内容霍乱诊断标准WS289-20082009年霍乱检测具体要求一．标本的收集1．标本种类患者粪便、呕吐物、肛拭子必取肠道门诊以患者粪便为主；爆发疫情患者粪便、呕吐物、肛拭子必取；水样，水生动物、污染的标本以涂抹为主、食品（可疑或剩余）等标本。2．标本数量水样便取1-3mL成形便取指甲大小肛拭子用直肠棉拭或采便管取水样便或呕吐物取1-3mL；成形便取指甲大小；肛拭子用采便管；水样500mL，涂抹标本以3-5支无菌棉拭涂抹后为一件。食品液体：250mL；固体：25-50克6标准与要求（二）内容霍乱诊断标准WS289-20082009年霍乱检测具体要求二．标本的送检1．运送液种类碱性蛋白胨水（增菌液）；文腊二氏保存液；Cary-Blair二氏半固体保存培养基；pH8.8~9.0碱性蛋白胨水（增菌液）2．运送液数量标本与保存液比例约为1：5pH8.8~9.0碱性蛋白胨水（增菌液）10—15mL7标准与要求（三）内容霍乱诊断标准WS289-20082009年霍乱检测具体要求三．标本的分离培养1．直接分离培养急性期病人水样便直接接种选择性培养基肠道门诊：急性期病人水样便直接接种选择性培养基；动力、制动试验。爆发疫情患者粪便、呕吐物、肛拭子直接接种选择性培养基。2．增菌后分离培养所有标本用碱性蛋白胨水放37℃增菌6~8h后接种选择性培养基肠道门诊非水样便放37℃增菌6~8h后接种选择性培养基；动力、制动试验。爆发疫情患者粪便、呕吐物、肛拭子放37℃增菌6~8h后接种选择性培养基；外环境标本37℃二次增菌。8标准与要求（三）内容霍乱诊断标准WS289-20082009年霍乱检测具体要求三．标本的分离培养3.分离培养基种类强选择性培养基：庆大霉素琼脂、4号琼脂和TCBS琼脂弱选择性培养基：碱性营养琼脂强选择性培养基：庆大霉素琼脂4.培养时间和可疑菌落的描述标本接种分离培养基放37℃培养18~24h可疑菌落：庆大霉素琼脂和4号琼脂：灰色、圆形、透明或半透明、光滑、湿润、扁平、大小约为2mm.碱性营养琼脂:无色，其余同上灰色、圆形、透明或半透明、光滑、湿润、扁平、大小约为2mm.9标准与要求（四）内容霍乱诊断标准WS289-20082009年霍乱检测具体要求四．菌株鉴定1.菌株初筛玻片凝集试验:O1、0139群挑庆大霉素琼脂、4号琼脂和碱性营养琼脂5个以上可疑菌落氧化酶试验:肠道门诊：玻片凝集试验O1、0139群挑庆大霉素琼脂9~10个可疑菌落10标准比较与要求（四）内容霍乱诊断标准WS289-20082009年霍乱检测具体要求四．菌株鉴定2.菌株复筛玻片凝集试验:氧化酶试验:区CDC:玻片凝集试验用普通琼脂的纯菌O1、0139群、小川、稻叶氧化酶试验PCR检测霍乱毒素基因2.菌株上送按菌株管理要求进行上送半固体一支普通琼脂一块立即送检或电话联系根据情况而定，填写统一的送检单11北京市肠道传染病样本送检表送检单位：送检日期：年月日标本来源：散发病例/疫情/监测/鉴定/其他（请注明）采样日期：年月日检测项目：霍乱弧菌/志贺菌/肠致泻性大肠杆菌/O157：H7/沙门菌/腹泻病毒/其他（请注明）编号姓名性别年龄主要症状粪便性状标本类型临床检测结果采样地点检测结果（所有检测结果均报）备注粪便可疑阳性培养物其他白细胞红细胞其他试验主要症状：1发热（℃）；2腹泻（次/天）；3腹痛；4恶心；5呕吐（次/天）；6里急后重；7其他（请描述，如呼吸道症状）：（可多选）粪便性状：1稀便，2水样便，3米泔水样便，4洗肉水样便，5粘液便，6脓血便，7血便，8其他（请注明）：检测腹泻病毒：需将原始粪便样本保存在便盒立即送检。24小时内不能送检的，冻存在-20℃冰箱内，运送时加冰运送。送样人及联系电话：收样单位：收样人：收样日期：年月日12北京市肠道门诊O1群与O139群霍乱弧菌的检验程序快速试验增菌分离培养直接分离培养（水样便）北京市疾病预防控制中心制37℃18~24小时10~20小时37℃6~8小时37℃18~24小时标本（粪便）分离培养（庆大霉素琼脂）玻片凝集