PCR-RFLP基因分型方法

PCR-RFLP基因分型方法---关于序列查找、引物设计和酶切位点分析概念聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性(restritionfragmentlengthpolymophism，RFLP):是指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。PCR-RFLP:是在PCR和DNA序列分析基础上产生的RFLP技术。该方法是通过PCR扩增一段DNA片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化PCR产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。概念概念确定基因序列设计引物选择内切酶电泳基因型Stepbystep基因序列查找://://expasy.org/sprot/基因序列查找选择gene输入基因名称基因序列查找基因的全称基因的物种来源引物设计引物设计引物一般原则基本原则：1.引物要跟模板紧密结合，2.引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，3.引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。需要考虑的因素：引物长度（primerlength）、产物长度（productlength）、序列Tm值(meltingtemperature)、ΔG值(internalstability)、引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）错误引发位点（falseprimingsite）、引物及产物GC含量（composition）引物一般原则引物的长度：15-30bp，常用的是18-27bp太短：特异性不好太长：延伸温度大于Taq酶的最适温度引物末端要求：3’端的序列要比5’端重要，引物3’端的碱基一般不用AA在错误引发位点的引发效率相对比较高，5’端序列对PCR影响不大，常用来引进修饰位点或标物。引物的GC含量：一般为40-60%，以45-55％为宜两条引物之间的GC含量不宜相差太大引物一般原则Tm值：尽量保证两条引物的Tm值相匹配。最好相差不要大于5度引物二聚体及发夹结构的能量：绝对值一般不要超过4.5最好不要位于3’末端否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，如果在5’末端对反应就没有多大的影响了ΔG值:反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9。如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发PCR-RFLP引物特殊要求PCR产物的长度：200-1000bp酶切后产物片断的大小差距：100bp以上引物设计工欲善其事，必先利其器PrimerPremier5.0引物设计Oligo6.0引物评价引物设计新建窗口输入序列PrimerPremier5.0突变位点选取突变位点前后约500bp长度的碱基PrimerPremier5.0引物设计酶切位点分析PrimerPremier5.0自动搜索引物手动编辑引物PrimerPremier5.0前引物的位置（必须超过突变位点）后引物的位置（必须在突变位点之后）PCR产物的长度引物的长度PrimerPremier5.0引物的综合评分，分越高引物越好引物的详细信息引物序列PrimerPremier5.0发夹结构二聚体错配交叉二聚体PrimerPremier5.0更高级应用：参数的设置手动搜索或者修改引物搜索特殊引物（比如单条引物的搜索等）引物纯化方式的选择去盐（RPC、Desalted）纯化它是一种对DNA有特异性的吸附的树脂，能有效地去除盐分及小片段的DNA分子。这种引物可以用于常规PCR、DNA测序等实验。PAGE纯化PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的纯度大于95%，对长链OligoDNA(大于50mer)的纯化特别有效。适用于PCR用引物(如定点诱变引物)，DNA测需用引物，各种探针等。HPLC纯化采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达99%。适用于各种基因工程试验，特别是：荧光标记DNA、长链DNA、PCR克隆，定点突变，人工合成基因等。几种特殊类型的引物设计引入酶切位点引物设计Takara定点诱变试剂盒定点诱变引物设计Quikchange定点诱变试剂盒定点诱变引物设计引入酶切位点引物设计为什么要引入酶切位点？突变位点没有内切酶或者合适的内切酶通过人为的在引物上改变一个碱基从而使之与突变位点的碱基构成新的酶切位点引入酶切位点引物设计tctcaacaaaaTcaaaactgtaag突变位点，找不到合适的内切酶tctcaacaGaaTcaaaactgtaagHinfI可以使用PCR-RFLP的方法基因分型引入酶切位点引物设计基本原则：人为改变原序列上的一个碱基从而与突变位点的碱基构成新的合适的酶切位点具体要求：1.内切酶的选择：便宜、条件稳定和常用。2.引物的位置：引物3’端的最后一个碱基一定不能超过突变位点3.改变酶切位点的位置：尽量远离突变位点，最好不要紧邻突变位点，一般相隔2-3个碱基4.引物的长度：在保证引物质量的前提下，尽可能的加长引物的长度。最好不要小于20bp引入酶切位点引物设计5.PCR产物的长度：最好能位于100-200bp之间，琼脂糖凝胶电泳时更好区分。6.突变位点附近的引物设计受限，因此，另外一条引物应该尽量设计好。7.在有多种内切酶可供选择时，尽量选择切频率高的基因型的内切酶。以提高灵敏度。定点诱变引物设计（一）定点诱变引物设计（一）定点诱变引物设计（二）5'-ggattcagaatgattctctccaagaaaacatcctttttggatg-3'3'-cctaagtcttactaagagaggttcttttgtaggaaaaacctac-5'酶切位点分析新建窗口酶切位点分析输入序列，注意粘贴的序列不能有空格和段落标记符号大写突变位点以便于辨认酶切位点分析选择菜单AnalyzeRestrictionmaping酶切位点分析酶谱选择点击确定酶切位点分析可供选择的限制性内切酶酶切位点分析酶切位点个数酶切位置酶切后片断大小电泳琼脂糖凝胶电泳：操作简便、快捷、灵敏。是分离、鉴定和纯化核酸的首选的标准方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨力高于普通琼脂糖凝胶电泳，适用于低分子质量蛋白、寡核苷酸的分离和DNA序列的分析。电泳琼脂糖凝胶浓度（%）线性DNA分子大小（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3凝胶浓度和DNA分子的有效分离范围电泳157bp132bp344bp310bp相差25bp相差34bp结果分析频率统计H-W平衡分析统计检验最终结果祝大家实验顺利