淋巴细胞的分离和功能检测

淋巴细胞的分离和功能检测SeparationandAssaysforLymphocytes第一节外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclercell，PBMC):单核细胞淋巴细胞人不同细胞的漂浮密度红细胞：1.09~1.1嗜酸性：1.09~1.095嗜中性：1.080~1.085B细胞：1.062~1.075T细胞：1.065~1.077NK：1.050~1.070单核细胞：1.050~1.066血小板：1.030~1.060Ficoll分层液分离法属于单次密度梯度离心分离法分离液组成：聚蔗糖（商品名为Ficoll）泛影葡胺（常用商品为isopaque、hypaque）故又称Ficoll-hypaque分层液Ficoll：分子量：40KD高密度低渗透压无毒性使用浓度：60g/L(密度：1.020）泛影葡胺：使用浓度：340g/L（密度：1.200）Ficoll-hypaque的密度：分离人外周淋巴细胞：1.077±0.001分离小鼠淋巴细胞：1.088分离马淋巴细胞：1.090操作过程：将抗凝全血以Hank’s液适当稀释后轻轻叠加在分层液上.试验尽量在低温下进行（4℃~8℃或冰浴）。水平式离心（2000rpm，20min）吸出白色云雾状单个核细胞层，洗涤3次备用密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）细胞活性：＞95%单个核细胞纯度：＞95%细胞获得率：＞80%最佳温度：20℃Percoll分离法属于连续密度梯度离心分离法Percoll：包有乙烯吡咯顽酮的硅胶粒特点：渗透压低、黏度小、无毒扩散常数低，可形成稳定的梯度操作：Percoll原液（密度1.135）加等量磷酸缓冲液高速离心，使分层液形成连续密度梯度将细胞悬液叠加在分层液上，低速离心后得到四个细胞层吸取所需细胞层，洗涤备用密度梯度分离单个核细胞（Percoll分层液）细胞活性：＞95%细胞纯度：＞98%细胞获得率：＞75%最佳温度：20℃密度梯度离心法注意事项：无菌操作安全防护注意最佳温度操作适当稀释血液样品（稀释倍数至少1倍，但要收集血浆成分则不能稀释）第二节：外周血淋巴细胞的分离和纯化外周血单个核细胞中还含有少量单核细胞，甚至还有少量红细胞和血小板，若特定试验要求应该除去这些成分.红细胞去除法低渗裂解法PBMC中加入无菌双蒸水，调节浓度至2X106，轻轻混匀45s，即刻加入等体积1.8%氯化钠，使溶液恢复等渗。氯化铵处理法PBMC中加入一定量的0.83%的氯化铵溶液，轻轻震荡2分钟，即可溶解红细胞血小板去除法离心洗涤法HBSS或PBS洗涤分离的PBMC2-3次，可去除大部分血小板。单核细胞去除法粘附法单核细胞37℃下能粘附在塑料或玻璃表面，淋巴细胞则不能，将PBMC置于细胞培养瓶中培养1小时，即可去除单核细胞。淋巴细胞纯度：＞95%活性：＞95%L-亮氨酸甲酯法L-亮氨酸甲酯在溶酶体酶的作用下可转化成有毒L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯，导致单核细胞破坏。同时可去除NK细胞和Tc细胞。淋巴细胞纯度：＞99%活性：＞95%羰基铁吞噬法单核细胞可吞噬羰基铁粉，吞噬后的细胞比重增大，分层液密度梯度离心时沉淀于管底。免疫磁珠法利用抗体致敏的磁珠与细胞结合，让细胞通过磁细胞分选仪，分离具有特异标记的免疫细胞。第三节外周血淋巴细胞及其亚群的选择性分离及纯化T细胞及其亚群的选择性分离尼龙棉柱分离法利用B细胞和单核细胞易于粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分离操作：将尼龙毛（聚酰胺纤维）填充于5-6mm内径的塑料管中，单个核细胞悬液加入，37℃1-2小时，10%-20%FCS灌洗，收集洗脱液。回收率：20%~30%T细胞纯度：＞90%一般不用于分离B细胞花环形成法-E花环成熟T细胞表面有绵羊红细胞受体，即E受体（CD2),可与绵羊红细胞结合形成花环，经Ficoll密度梯度离心，再经裂解即可获得T细胞。T细胞回收率差异大T细胞纯度：＞95%分离过程可能激活某些T细胞免疫磁珠分离法将抗体与磁性微珠结合形成免疫磁珠（immmunomagneticbeads，IMB),免疫磁珠与细胞结合后，在外加磁场的作用下，免疫磁珠-细胞复合物被吸附，从而起到分离的作用。单克隆抗体-磁珠分离系统（monoclonalantibody-magneticcellsorting，MACS)阳性分离：获得被吸附的细胞阴性分离：获取非吸附细胞分离纯度：80%~99%得率：60%~90%，仅次于流式细胞仪CD4+T细胞流式细胞仪分选法流式细胞术（flowcytometry，FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的分析和分选技术流式细胞仪流动室和液流系统激光源和光学系统光电管和检测系统计算机和分析系统细胞纯度：＞99%细胞得率：＞90%细胞活性：＞95%B细胞及其亚群的选择性分离尼龙棉柱法操作见T细胞分离部分该法曾经是经典的B细胞分离方法，但收获率较低，现已很少使用EA花环B细胞表面带有IgGFc段受体，AgAb复合物中IgGFc段牢固结合；这类红细胞抗体致敏的动物红细胞（EA)黏附在B细胞周围形成花环。免疫磁珠法流式细胞分选法细胞的保存及活力测定•保存10%~20%的灭活小牛血清等渗培养液重悬。短期置4℃，长期：二甲亚砜+-196℃•活力测定台盼兰染色死细胞呈蓝色，活细胞不着色。第四节淋巴细胞表面标记的检测AssaysforLymphocyteSurfaceMarkers淋巴细胞的表面标志CD抗原特异性CD2E受体、全部T细胞和部分NK细胞CD3成熟T细胞CD4Th细胞、Mφ、HIV受体CD8Tc细胞、NK细胞的亚型CD25IL-2受体、活化T细胞CD16、CD56NK细胞免疫荧光技术直接法间接法微量细胞毒实验针对表面标记的单抗与免疫细胞结合后，在补体的作用下会杀伤该细胞，细胞膜失去屏障作用，加入伊红染料后会将细胞染成红色，阴性细胞不着色。免疫酶染技术抗体用特异性的酶标记后不影响其与抗原结合，将酶标记抗体与免疫细胞作用，在酶底物存在时，阳性细胞将产生颜色反应，在光学显微镜下即可对免疫细胞进行定量和定性ABC法（Avidin-biotin-HRPcomplex）APAAP(Alkalinephosphatase-anti-alkalinephosphatasetechnique)碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色法(APAAP法)，用兔抗鼠IgG起搭桥作用，其中一个Fab段连接McAb，另一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分子的存在。APAAP酶免疫桥联法第五节T、B淋巴细胞功能检测一、T细胞功能检测（一）T细胞增殖试验T细胞在体外受有丝分裂原或抗原刺激后，细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应。如细胞变大、胞质增多、出现空泡、核质疏松、核仁明显并转化为淋巴母细胞，又称淋巴细胞转化试验（lymphocytetransformationtest,LTT)丝裂原诱导的增殖反应技术方法1.用RPMI－10将PBMC配成1x106/ml的悬液。2.用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀释液。3.96孔板中选择一行（共12孔），每孔中加入100µl细胞。指定每相邻3孔为一组。前3组分别加入一种稀释度的PHA溶液，最后一组加培养液（对照组）。4.37°C，5％CO2，54h。5.配制浓度为50µci/ml的3HTdR。T细胞增殖功能测定丝裂原诱导的增殖反应6.每孔加入50µci3HTdR，继续培养18h。7.用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管中。溶解细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗去未掺入的3HTdR，最后用100％的甲醇洗涤，以利滤纸干燥。8.将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。9.扣除本底，计算每一组3个复本的平均数。T细胞增殖功能测定丝裂原诱导的增殖反应影响因素1.细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检查细胞活力。2.培养液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可采用灭活的AB血清。3.细胞培养板类型：根据细胞数量采用不同形状底部的培养板。4.微生物污染：可降低细胞增殖能力。T细胞增殖功能测定单向混合淋巴细胞培养反应原理T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个不同个体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间MHC的差别的程度成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体之间MHC差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细胞培养试验。将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者MHC的反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培养反应。T细胞增殖功能测定单向混合淋巴细胞培养试验方法1.分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1x106/ml。2.刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25µg，37°C，5％C，30min）或放射性核素照射（2000rad）的方法处理刺激细胞。3.96孔板中，每孔加入1x105的刺激细胞和1x105反应细胞。37°C，5％CO2，4～6d。加3HTdR，继续培养18h。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞。3复本。4.收集细胞，液闪仪计数，打印结果。T细胞增殖功能测定单向混合淋巴细胞培养5.计算相对反应（RR）（实验组cpm－阴性对照组cpm）RR＝阳性对照组cpm－阴性对照组cpmT细胞增殖功能测定单向混合淋巴细胞培养注意点1.细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细胞活力。2.培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或抑制反应。3.本底应小于2000rpm，阳性对照组应大于20000rpm。T细胞增殖功能测定成熟淋巴细胞转化淋巴细胞抗原诱导的特异性增殖反应原理本试验测定T细胞在体外对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接触的抗原，也可以是曾经免疫过的抗原。常用的测定回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（PPD）和破伤风类毒素（TT）。这2种抗原都被常规列入计划免疫接种范畴，成人应该对它们有回忆反应。在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应可减弱或消失。T细胞增殖功能测定抗原性刺激物：破伤风类毒素链球菌激酶纯化蛋白衍生物白色链球菌同种异型抗原（HLA)抗原诱导的特异性增殖反应方法（以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例）1.分离PBMC和APC，APC用丝裂霉素或放射性核素处理。2.96孔板中每孔加入1x105PBMC和1x104APC。3.每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同孔中抗原终浓度分别为0、1、5、10和20µg/ml。每一种浓度设3复本。4.37C°，5％CO2，6天。5.加3HTdR，继续培养18小时。计数。T细胞增殖功能测定抗原诱导的特异性增殖反应结果解释1.对于接种过破伤风疫苗者来说，本试验结果呈低反应反映患者对破伤风类毒素特异性应答能力低下或全身免疫缺陷。2.HIV感染者反应低下反映CD4+T细胞减少导致的免疫缺陷。T细胞增殖功能测定抗原诱导的特异性增殖反应注意点1.培养液中最好用人AB血清。2.此T细胞增殖反应需要APC。如使用纯化T细胞，需加5％～10％自身APC。T细胞增殖功能测定抗原诱导的特异性增殖反应应用实践1.丝裂原诱导的增殖反应临床上用于评估T细胞对多克隆刺激剂的增殖能力，反映T细胞基本免疫功能，即T细胞群总体的信息，不能反映个别T细胞克隆的情况PHA常用于测试人T细胞增殖能力，ConA常用于测试小鼠T细胞增殖能力。T细胞增殖功能测定抗原诱导的特异性增殖反应应用实践2.单向混合淋巴细胞反应1）本方法主要用于估计器官移植前供体与受者之间MHC相配程度。2）如培养时间超过96小时，可制备细胞毒性T细胞（CTL）。T细胞增殖功能测定抗原诱导的