食品专业基础实验指导书-生物化学实验

《食品质量与安全》专业基础实验指导书上海理工大学医疗器械与食品学院实验实训中心1目录课程名称：《生物化学实验指导》实验名称：实验一蛋白质含量的测定－考马斯亮蓝G250染色法实验二蛋白质的两性性质及等电点的测定实验三紫外吸收法测定核酸的含量实验四可溶性总糖的测定（蒽酮比色法）2实验一蛋白质含量的测定－考马斯亮蓝G250染色法一、实验目的：通过实验掌握蛋白质的定量测定方法。二、预习要求：要求预习实验讲义。三、实验原理：考马斯亮蓝G250测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。四、实验设备与器材：仪器721型分光光度计、分析天平（万分之一）、量筒（100ml）、烧杯(250ml)、移液管(1ml,5ml)、漏斗、漏斗架、容量瓶(100mL,1000mL)、试管试剂：牛血清白蛋白蛋白质标准溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为100μg/mL的蛋白溶液。考马斯亮蓝G250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85％的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容至1000mL。此溶液在室温下可放置1个月。395％乙醇溶液85％磷酸五、实验内容与步骤：1、标准曲线绘制取6支试管，按下表加入各试剂。管号012345100μg/ml蛋白标准液／mL00.20.40.60.81.0蒸馏水／mL1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝液／mL5.05.05.05.05.05.0加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。以各管相应标准蛋白质含量（g）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取待测蛋白样液0.5mL放入试管中，加入蒸馏水0.5mL混匀后，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量，以蒸馏水作空白样。3、结果计算样品中蛋白质含量（μg/g鲜重）＝C×离心后的体积（mL）/样品鲜重（g）式中C为在标准曲线上查得的蛋白质浓度（μg/mL）【注意事项】（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。六、思考题：1.除了考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量外，还学过哪些方法可测定蛋白质含量，这些方法各有何优缺点？4实验二蛋白质的两性性质及等电点的测定一、实验目的：（1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。（2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。二、预习要求：要求预习实验讲义。三、实验原理：蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N－端α－氨基与C－端α－羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等集团，他们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：HNCCOOHRHHNCCOONHCCOOHNHHHN332+--+++HHOHOH+--阳离子两性离子阴离子pHpIpH=pIpHpI电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。四、实验设备与器材：仪器：试管架，试管：15ml×6，刻度吸管：1ml×4，2ml×4，10ml×2，胶头吸管×2试剂：1、1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875ml，加水至50ml。2、0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。3、0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。4、0.2mol/LNaOH：称取NaOH2.000g，加水至50ml，配成1mol/LNaOH。然后量取1mol/LNaOH10ml，加水至50ml,配成0.2mol/LNaOH。55、0.2mol/L盐酸：吸取37.2%（比重1.19）盐酸4.17ml，加水至50ml，配成1mol/L盐酸。然后吸取1mol/L盐酸10ml，加水至50ml，配成0.2mol/L盐酸。6、0.01%溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g，加0.29ml1mol/LNaOH，然后加水至50ml。7、0.5%酪蛋白溶液：称取酪蛋白（干酪素）0.25g放入50ml容量瓶中，加入约20ml水，再准确加入1mol/LNaOH5ml，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5ml，最后加水稀释定容至50ml，充分摇匀。五、实验内容与步骤：一、蛋白质的两性反应（1）取一支试管，加0.5%酪蛋白3ml，再加溴甲酚绿指示剂4滴，摇匀。此时溶液呈蓝色，无沉淀生成。（2）用胶头滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸，边加边摇直到有大量的沉淀生成。此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。（3）继续滴加0.2mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液颜色的变化。（4）滴加0.2mol/LNaOH进行中和，沉淀又出现。继续滴加0.2mol/LNaOH，沉淀又逐渐消失。观察溶液颜色的变化。二、酪蛋白等电点的测定（1）取同样规格的试管7支，按下表精确地加入下列试剂：试剂（ml）管号12345671.0mol/L乙酸1.60.8000000.1mol/L乙酸00410000.01mol/L乙酸00002.51.250.62H2O2.43.2031.52.753.38溶液的pH3.53.84.14.75.35.65.9（2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1ml，边加边摇，摇匀后静置5min，观察各管的混浊度。（3）用－、+、++、+++等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。【注意事项】缓冲液的pH值必须准确。六、思考题：61．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。2．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？7实验三紫外吸收法测定核酸的含量一、实验目的：学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。二、预习要求：要求预习实验讲义。三、实验原理：核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C－C＝C－），能够强烈吸收250－280nm波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。四、实验设备与器材：仪器：分析天平、紫外分光光度计、冰浴或冰箱、离心机、离心管（10mL）、烧杯（10mL）、容量瓶（50mL、100mL）、移液管（0.5mL、2mL和5mL）、药品勺和玻璃棒、试管和试管架等；试剂：1、5%~6%氨水：用25%~30％氨水稀释5倍。2、钼酸铵-过氯酸试剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水。3、核酸样品DNA或RNA。五、实验内容与步骤：1．核酸样品纯度的测定（1）准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量蒸馏水（或无离子水）调成糊状，再加适量的水，用5%~6%氨水调至pH7，定容至50mL。（2）取两支离心管，甲管内加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水；乙管内加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照）。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置30min，3000r/min离心10min。从甲、乙两管中分别取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选用光程为1cm的石英比色杯，在260nm波长下测其光密度。（3）计算8如果待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则可将样品配制成一定浓度的溶液（20~50μg/mL）在紫外分光光度计上直接测定。2．核酸溶液含量的测定当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260nm处光密度作为对照。（1）取2支离心管，每管各加入2mL待测的核酸溶液，再向甲管内加2mL蒸馏水，向乙管内加2mL沉淀剂。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置10min，3000r/min离心10min。将甲、乙两管清液分别稀释至光密度在0.1~1.0之间。选用光程为1cm的石英比色杯，在260nm波长下测其光密度OD260nm。（2）计算六、思考题：1．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？9实验四可溶性总糖的测定（蒽酮比色法）一、实验目的：掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。二、预习要求：要求预习实验讲义。三、实验原理：强酸可使糖类脱水生成糠醛，生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在620nm处有最大吸收。在10-100ug范围内其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。这一方法有很高的灵敏度，糖含量在30ug左右就能进行测定，所以可作为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。四、实验设备与器材：仪器：分光光度计、电子天平、烧杯（50mL×1）、大试管（9支）、试管架，试管夹、漏斗、漏斗架、容量瓶（50mL×2）、刻度吸管（1mL×3、2mL×1、5mL×1）、水浴锅、磁力搅拌器等；试剂：1、葡萄糖标准液：l00ug/mL2、浓硫酸；3、蒽酮试剂：0.2g蒽酮溶于100mL浓H2SO4中当日配制使用。五、实验内容与步骤：1、葡萄糖标准曲线的制作取7支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：管号1234567葡糖标准液(ml)00.10.20.30.40.60.8蒸馏水(ml)10.90.80.70.60.40.2葡萄糖含量(ug)0102030406080在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0mL，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸l0min取出，用流水冷却，室温放置10min，在620nm波长下比色。以标准葡萄糖含量(ug)作横坐标，以吸光值作纵坐标，作出标准曲线。102、植物样品中可溶性糖的提取准确称取大豆粉0.5g,放入50mL烧杯中，加水25mL后于磁力搅拌器上搅拌15min，过滤，滤液收集在50mL容量瓶中，定容至刻度。吸取提取液1mL，置另一50mL容量瓶中，以蒸馏水稀释定容，摇匀测定。3、测定吸取lmL已稀释的提取液于大试管中，加入4.0mL蒽酮试剂，以下操作同标准曲线制作。比色波长620nm，记录吸光度，在标准曲线上查出葡萄糖的含量(ug)。4、计算【注意事项】1、该显色反应非常灵敏，溶液中切勿混入纸屑及尘埃；2、H2SO4要用高纯度的；3、不同糖类与蒽酮的显色有差异，稳定性也不同。加热、比色时间应严格掌握。六、思考题：1、用水提取的糖类有哪些？2、制作标准曲线时应注意哪些问题？