银杏叶中银杏黄酮大孔树脂吸附分离性能的研究(设计)

银杏叶中银杏黄酮大孔树脂吸附分离性能的研究近近年年来来,,整整个个世世界界特特别别是是西西方方发发达达国国家家掀掀起起了了一一阵阵绿绿色色浪浪潮潮。。国国际际上上渐渐渐渐形形成成了了一一种种共共识识------得得自自绿绿色色生生命命((植植物物))的的产产品品往往往往具具有有较较大大的的安安全全性性。。银银杏杏作作为为近近代代植植物物药药开开发发研研究究的的热热点点之之一一,,正正处处于于这这一一浪浪潮潮的的前前沿沿。。银银杏杏树树为为银银杏杏科科植植物物银银杏杏((GGiinnkkggoobbiilloobbaa..LL..))又又名名公公孙孙树树,,为为我我国国特特产产植植物物..银银杏杏叶叶提提取取物物((GGRREE))主主要要含含黄黄酮酮,,内内酯酯两两类类活活性性成成分分,,黄黄酮酮以以山山柰柰酚酚((kkaaeemmppffeerraall)),,槲槲皮皮素素((qquueerrcceettiinn)),,异异鼠鼠李李素素((iissoorrhhaammnneettiinn))的的甙甙类类化化合合物物为为主主,,内内酯酯以以白白果果内内酯酯及及银银杏杏内内酯酯AA..BB..CC((ggiimmkkggoolliiddeeAA..BB..CC))为为主主。。银银杏杏黄黄酮酮具具有有捕捕获获游游离离基基,,抑抑制制血血小小板板活活化化因因子子((PPFFAA))扩扩张张冠冠动动脉脉血血管管,,增增加加心心脑脑血血量量等等功功效效。。可可用用于于治治疗疗由由于于血血管管老老化化,,脑脑血血管管供供血血不不足足所所导导致致的的外外周周循循环环不不良良,,眩眩晕晕,,耳耳鸣鸣,,头头痛痛失失眠眠,,短短期期记记忆忆不不良良听听力力障障碍碍,,精精神神不不振振等等,,同同时时,,还还可可以以用用于于研研制制营营养养口口服服液液,,保保健健食食品品与与化化妆妆品品,,其其应应用用日日益益广广泛泛有有关关银银杏杏提提取取方方法法报报道道很很多多,,德德国国首首先先提提出出银银杏杏制制剂剂含含量量的的质质量量标标准准::黄黄酮酮糖糖甙甙≥≥2244%%萜萜内内酯酯≥≥66%%和和白白果果酸酸≤≤22××1100--66。。为为了了是是银银杏杏产产品品能能出出口口创创汇汇,,参参加加国国际际市市场场的的大大循循环环,,不不断断探探索索新新的的提提取取方方法法工工艺艺,,研研究究并并选选择择出出简简单单且且高高效效的的工工艺艺方方法法以以成成为为这这个个领领域域的的焦焦点点。。目前有关银杏叶的提取工艺主要以乙醇为提取溶剂，由于乙醇系有机溶剂，消耗大、成本高、且生产过程存在易燃等安全隐患，为此我们根据银杏叶异黄酮有一定的水溶性，试改用水做提取溶剂，以银杏黄酮为目标，对其银杏黄酮进行了正交提取工艺研究，并对最佳提取工艺得到的提取液进行了大孔吸附树脂吸附分离性能研究，以期为银杏叶银杏黄酮的开发利用提供依据。1材料与仪器1.1材料银杏叶(采自陕西略阳)，自然干燥，粉碎。1.2试剂银杏黄酮对照品(含量≥98%)：购自Sigma公司;大孔树脂LX-38、LX-1、D101，AB-8购自西安蓝小科技开发有限公司。试剂均为分析纯。1.3仪器电热恒温水浴锅(H·H·S21-6C，上海医疗器械五厂);电子分析天平(FC204，上海精科实业有限公司);UV-762紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);旋转蒸发器(上海亚蓉生化仪器厂);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，索式提取器，电热鼓风干燥箱;植物粉碎机(FZ102，天津市泰斯特仪器有限公司)2方法2.1银杏叶银杏黄酮、银杏内酯的薄层检测银杏叶银杏黄酮的薄层检测硅胶薄板制作称取4g硅胶G置于研钵中，加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液12ml，研磨15min后铺于20×10cm的干净玻璃平板上，要求平整无气泡，然后晾干即可。展开剂配制取展开剂氯氯仿仿--甲甲醇醇--乙乙酸酸乙乙酯酯按按22：：11：：11的比例配制60ml（30：15：15）作为展开剂。薄板活化：将制好的硅胶薄板在105℃下活化30min。点样：点样点距板子底端1.5cm左右，所有点样点位于同一直线上，尽可能向中间靠拢，每个点样点点样约20μl，点样点尽可能小。饱和：将板子不没入层析缸内的展层剂中，在展层剂的蒸气中饱和约0.5h。层析：将板子下端插入展层剂中进行展开，当展层剂前沿距板子上端约1.5cm时取出板子，自然晾干。观察：展开取出晾干后，喷喷55%%AAllccll33的的乙乙醇醇溶溶液液，，热热风风吹吹干干、、并并在在336655nnmm荧荧光光灯灯下下观观察察。。Rf。银杏叶银杏内酯的薄层检测硅胶薄板制作称取4g硅胶G或或硅硅胶胶GGFF225544置于研钵中，加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液12ml，研磨15min后铺于20×10cm的干净玻璃平板上，要求平整无气泡，然后晾干即可。展开剂配制取展开剂甲甲苯苯--丙丙酮酮按按77：：33的比例配制50ml（35：15）作为展开剂。薄板活化：将制好的硅胶薄板在105℃下活化30min。点样：点样点距板子底端1.5cm左右，所有点样点位于同一直线上，尽可能向中间靠拢，每个点样点点样约20μl，点样点尽可能小。饱和：将板子不没入层析缸内的展层剂中，在展层剂的蒸气中饱和约0.5h。层析：将板子下端插入展层剂中进行展开，当展层剂前沿距板子上端约1.5cm时取出板子，自然晾干。观察：先先喷喷细细水水雾雾定定位位后后117700℃℃加加热热3300分分钟钟，，若若有有银银杏杏内内酯酯存存在在，，在在波波长长225544nnmm下下出出现现苍苍黄黄色色荧荧光光斑斑点点，，银银杏杏内内酯酯BB的的RRff==00..2233左左右右。。2.2络络合合分分光光光光度度法法测测定定银银杏杏黄黄酮酮的的含含量量aa..标标准准曲曲线线的的制制备备精精确确秤秤取取芸芸香香叶叶甙甙rruuttiinn（（芦芦丁丁））3300mmgg，，用用3300%%乙乙醇醇溶溶液液溶溶解解并并定定容容至至110000mmll（（含含量量为为00..3300mmgg//mmll））分分别别吸吸取取标标准准液液11、、33、、55、、77、、99mmll于于2255mmll容容量量瓶瓶中中，，用用3300%%乙乙醇醇补补充充至至1122..55mmll,,加加入入00..77mmllNNaaNNoo22((11::2200)),,摇摇匀匀，，放放置置55分分钟钟后后，，加加入入00..77mmllAAll((NNoo33))33((11::2200)),,66分分钟钟后后加加入入55mmll11mmooll//LL的的NNaaooHH溶溶液液并并摇摇匀匀,,用用3300%%的的乙乙醇醇补补充充至至刻刻度度线线,,1100分分钟钟后后于于551100nnmm进进行行比比色色测测定定。。用用UUVV--226655可可记记录录分分光光光光度度计计测测定定结结果果如如下下毫毫升升001133557799浓浓度度值值((mmgg//mmll))0000..00112200..00336600..00660000..00884400..110088OODD值值bb..样样品品的的制制备备及及测测定定准准备备称称取取22克克银银杏杏叶叶粉粉碎碎至至粉粉末末,,放放置置于于索索氏氏提提取取管管中中。。加加约约115500mmll甲甲醇醇热热回回流流至至回回流流液液无无色色，，减减压压浓浓缩缩至至小小体体积积、、定定容容至至115500mmll，，摇摇匀匀待待测测，，从从中中移移取取55mmll到到2255mmll中中的的容容量量瓶瓶中中，，按按标标准准曲曲线线的的测测定定方方法法加加样样，，并并用用UUVV--226655紫紫外外分分析析仪仪测测定定其其浓浓度度。。精精确确产产品品5500mmgg，，用用3300%%乙乙醇醇溶溶液液溶溶解解并并定定容容至至110000mmll。。结结果果标标准准曲曲线线如如下下::测定结果：2.3大孔树脂静态吸附实验表1吸附树脂的物理性能型号极性比表面积/(m2/g)孔径/nmLX-38LX-1D101AB-82.3.1树脂的处理和再生：将树脂放入蒸馏水中，溶胀后浮选，用1moL/L的NaOH溶液浸泡4h，用蒸馏水洗至中性，然后用0.5moL/L的HCl溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至中性。用95%乙醇浸泡24h，不断搅拌，用蒸馏水洗至无白色混浊，并且无醇味。用蒸馏水浸泡待用。树脂简单再生可用含量为95%的乙醇洗至无色，即可使用，经多次使用的树脂吸附杂质较多，颜色较深，可用酸碱处理再生后使用。2.3.2银杏叶样液制备称取银杏叶100g，加600ml75%酒精超声提取30min，用4层纱布粗滤得粗滤液，残渣再加入500ml75%酒精超声提取30min，用4层纱布粗滤得粗滤液，合并两次粗滤液，在用滤纸或离心过滤得银杏叶提取液。银杏叶提取液减压浓缩至无醇味，加65℃温水至400ml进行水沉，静置过夜，次日下层为油状膏子保留备检，上层液过滤并定容至400ml，得银杏叶样液（g/ml）。2.3.3饱和吸附量的测定准确称取经预处理的用滤纸吸干表面水分的树脂1.00g于100ml三角瓶中，精密加入mg/ml的银杏叶银杏黄酮溶液20.0ml，在25℃，120r/min的条件下振荡吸附18-24h。测定吸附后溶液中银杏黄酮的量，并按下式计算树脂的饱和吸附量。饱和吸附量=(加入的银杏黄酮-未吸附的银杏黄酮)/树脂的量。2.3.4树脂脱附率的测定将上述经过24h静态吸附银杏黄酮的树脂分离出来，吸干表面水分，然后加入70%的乙醇20.0ml，在25℃，120r/min的条件下振荡脱附2h。测定脱附液中银杏黄酮的量，按下式计算脱附率。脱附率(%)=洗脱出的银杏黄酮/(加入的银杏黄酮-未吸附的银杏黄酮)×100%。不同树脂对银杏黄酮的吸附量和解吸实验结果见表。表大孔树脂静态吸附及解吸性能型号吸附量/(mg/g)解吸率/%LX-38LX-1D101AB-8从表可看到4种树脂中树脂的吸附量最大，最小，在实际生产应用中，对树脂要求不仅要求吸附量大，而且要求解吸率要高，以保证有效成分的最大回收。在这2种树脂中树脂不仅具有大的吸附量，而且具有较高的解吸率，因此认为树脂是富集纯化银杏黄酮较为理想的吸附材料。2.3.5大孔吸附树脂解吸特性的考察按2.3.3项的方法得到吸附饱和的树脂5份,分别精确加入20mL的15%、30%、45%、60%和75%的乙醇溶液进行解吸,计算不同浓度乙醇溶液对银杏黄酮的解吸率。选择洗脱剂不仅要求具有使大孔树脂溶胀，减弱被吸附物质与树脂之间的吸附力，而且要求可溶解被吸附物质，本实验选用洗脱剂为乙醇，考察不同乙醇溶液浓度对银杏黄酮的解吸效果,结果见图1。洗脱剂浓度15%30%45%60%75%解吸率%将表做图图洗脱剂浓度对银杏黄酮解吸的影响由图可以看出，15%和30%的洗脱液解吸率较低，而60%的洗脱液基本上可以将银杏黄酮完全从树脂上解吸下来，从纯化的纯度角度和节约试剂用量的角度考虑，应选用60%乙醇作为洗脱剂，没有必要使用75%的乙醇作为洗脱剂。2.3.6pH对树脂吸附效果的影响准确称取预处理好的用滤纸吸干表面水份的湿树脂5份，每份1.0g，装入50mL具塞锥形瓶中，分别加入用2mol/L的盐酸和2mol/L氢氧化钠调节pH值的溶液20mL，在摇床上振摇18-24h，测定吸附后溶液中银杏黄酮的量。pH值3.54.55.56.57.5吸附量将表做图由图可以看出,pH值在4.5-5.5之间,树脂对银杏黄酮的吸附量是最大的,因为银杏叶黄酮类化合物分子中含有酚羟基、羧基,呈弱酸性,酸性化合物在酸性溶液中易吸附;此外,酸性条件下有利于葡萄糖苷型异黄酮水解成苷元型,更容易被树脂所吸附。酸性太强,树脂的吸附性能会受到影响,吸附率下降;碱性增强,会使异黄酮的亲水性增强,从而使吸附量下降。2.4大孔树脂动态吸附实验2.4.1动态吸附透过曲线的测定吸附材料选取树脂，采用16mm×300mm的玻璃层析柱作为吸附柱，称取预处理好