银柴胡中豆甾-7-烯醇检测方法的研究

银柴胡中豆甾-7-烯醇定性定量方法研究李曼玲，康琛，赵宇新（中国中医科学院中药研究所）[摘要]目的：建立银柴胡成分的定性定量分析方法。方法：采用薄层色谱法对银柴胡药材中的豆甾-7-烯醇进行定性鉴别；以高效液相色谱法蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）测定银柴胡药材中的豆甾-7-烯醇含量。结果：薄层鉴别重现性良好；HPLC色谱条件下，豆甾-7-烯醇获良好分离，进样量在0.070µg～0.348µg范围内与峰面积积分值的对数呈良好线性关系（r=0.9997）,加样回收率平均值为101.9%，RSD=3.0%。结论：为银柴胡的质量控制提供了可靠的检测方法。[关键词]银柴胡；豆甾-7-烯醇；高效液相色谱法；蒸发光散射检测器QualitativeandQuantitativeMethodsofStigmast-7-en-3-ol,(3β，5α，24s)inCommercialHerbaStellariadichotomaL.var.lanceolataBgeLIMan-ling，KANGChen，FENGWei-hong，ZHAOYu-xin(InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)[Abstract]:Objective:ToestablishqualitativeandquantitativemethodsofStigmast-7-en-3-ol,(3β,5α,24s)incommercialHerbaStellariadichotomaL.var.lanceolataBge.Methods:Stigmast-7-en-3-ol,(3β,5α,24s)hasbeenchosenasthereferencesubstanceforqualitativeandquantitativeanalysisofthedrug.Therefore,anewTLCmethodandnewHPLC-ELSDmethodwereestablished.Results:TheHPLC-ELSDmethodisavailable,possibleandaccurate.Includingthoseabove,aprotocolofthequalitystandardofthecrudedrug,StellariadichotomaL.var.lanceolataBge,hasbeenelaborated.[Keywords]StellariadichotomaL.var.lanceolataBge;Stigmast-7-en-3-ol,(3β,5α,24s);HPLC；ELSD银柴胡为石竹科植物银柴胡StellariadichotomaL.var.lanceolataBge.的干燥根。春、夏间植株萌发或秋后茎叶枯萎时采挖；栽培品于种植后第三年9月中旬或第四年4月中旬采挖，除去残茎、须根及泥沙，晒干。银柴胡主产于宁夏地区，临床上属于较常用中药，具有清虚热，除疳热之功能，用于阴虚发热，骨蒸劳热，小儿疳热等证收到良好的疗效。到目前为止尚未建立有效的质量评价方法，甾醇类成分在银柴胡中含量相对较多[1]，有文献报道此类成分也是其除虚热的主要活性物质[2]，所以对其中含量相对较高的豆甾-7-烯醇进行了提取分离、制备、鉴别及含量测定。从以往的文献报道来看，此类成分的含量测定多采用薄层扫描法[3]。豆甾-7-烯醇紫外为末端吸收，所以高效液相色谱方法选择了蒸发光散射检测器做为检测手段，建立了HPLC-ELSD的含量测定方法。方法简便、准确，适合于银柴胡的质量控制。通讯作者：李曼玲，Tel:[phone]-29391仪器、试剂与药材1.1仪器高效液相色谱仪：HP1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），HP3395积分仪（美国，安捷伦公司）,Alltech-500型蒸发光散射检测器（美国，Alltech公司）；HGA-5000空气发生器（北京，汇龙公司）。EDAS290薄层成像系统（美国冷泉港科技公司）。KQ-100型超声波清洗器（昆山市超声波仪器厂）。1.2试剂与药材试剂中乙腈为色谱纯，甲醇为GR，水为自制高纯水，其他试剂均为AR。对照品豆甾-7-烯醇为本课题组从银柴胡药材中分得，经熔点等理化常数和IR、NMR、UV、MS等光谱数据确定结构为豆甾-7-烯醇，经HPLC-ELSD面积归一化法测得其纯度为98%以上，符合含量测定的要求。银柴胡购自宁夏银川药材公司，经宁夏回族自治区生药室主任王英华鉴定为石竹科植物银柴胡StellariadichotomaL.varlanceolataBge.的干燥根。银柴胡对照药材购自中国药品生物制品检定所。2方法与结果2.1薄层色谱鉴别取药材粉末1g，加甲醇20mL，超声处理45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为样品溶液。另取银柴胡对照药材粉末1g，同法制备对照药材溶液。另取豆甾-7-烯醇对照品，加甲醇制成每1mL·mg-1的溶液，作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各6μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯（10:2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。样品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。喷以10%硫酸乙醇液，加热至斑点显色清晰。样品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。对所收集的十个市售药材进行了薄层鉴别，均检出相应的成分。2.2含量测定2.2.1色谱条件Nova-packC18色谱柱（4.6mm×150mm,4μm），柱温40℃；甲醇-乙腈-水-甲酸-三乙胺（47.5:46:6.5:0.1:0.1）为流动相，流速1mL·min-1；蒸发光散射检测器检测，漂移管温度75℃，气体流速2.60mL·min-1。理论板数按豆甾-7-烯醇峰计算应不低于2000。见图12.2.2样品溶液的制备取粉碎的样品约1g，精密称定，置50mL三角瓶中，精密加入甲醇20mL，称重，超声处理（功率250W，频率20kHz）45min，取出，放至室温，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。2.2.3精密度试验同一样品溶液连续进样5次，峰面积的平均值为165334，相对标准偏差为1.6%。2.2.4线性关系考察精密称取豆甾-7-烯醇对照品，用甲醇溶解，配制成0.0174mg·mL-1豆甾-7-烯醇的对照品溶液。分别进样4、8、12、16、20µL，以豆甾-7-烯醇进样量的常用对数值为自变量，以峰面积的常用对数值为因变量，求得回归方程为：Y=1.2409X+5.9572，r=0.9997。对照品进样量在0.070µg～0.348µg进样量与峰面积呈线性，采用外标两点法定量。2.2.5稳定性试验取样品溶液，分别于0、1、3、5、10h进样分析，测定峰面积的平均值为165453，相对标准偏差为1.5%。结果表明，样品中的豆甾-7-烯醇在10h内稳定，可以满足实验要求。2.2.6重复性试验取一批样品进行5次测定，计算测定结果的平均值为0.020%，相对标准偏差为2.7%。2.2.7加样回收试验称取已知含量的样品5份，分别加入豆甾-7-烯醇对照品，依样品溶液制备方法操作。测定结果见表1。表1豆甾-7-烯醇加样回收试验结果样品称量/mg样品含量/mg测定量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%500.70.10010.2045100.0501.20.10020.204299.6514.50.10290.2129105.4101.93.0535.30.10710.2167104.9502.10.10040.204299.4注：样品含量为0.02%；加入量均为0.1044mg2.2.8样品含量测定按上述方法，分别对10个不同市售的银柴胡药材中的豆甾-7-烯醇的含量进行测定。由外标两点法计算即得。结果见表2。见图2表2银柴胡样品测定结果样品来源含量（%）样品来源含量（%）宁夏银川0.020陕西西安0.012安徽合肥0.027广东广州0.025江苏扬州0.021甘肃西和0.026四川荷花池0.030北京东城0.017河南南阳0.024内蒙古赤峰0.0193结果与讨论3.1提取溶媒的选择根据豆甾-7-烯醇的性质，选择了甲醇、95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等溶媒进行了提取，最后均挥干溶剂，用甲醇转溶至20mL量瓶中，作为供试品溶液，对不同溶媒对测定结果的影响进行了考察，试验结果表明，使用甲醇作为提取溶媒，得到的峰面积比较大，所以选择甲醇作为供试品溶液制备的提取溶媒。3.2提取方法的选择使用甲醇作为提取溶媒，分别对超声、回流、冷浸不同的提取方法进行了考察。结果表明，使用超声波处理的方法制备供试品溶液，可以获得最佳的提取效果，故选择超声提取法作为供试品溶液的提取方法。3.3提取时间的选择使用甲醇作为提取溶媒，用超声处理作为提取方法，分别对超声处理30分钟、45分钟、60分钟进行了考察。结果表明，使用甲醇作为提取溶媒，采用超声提取法，提取45分钟可获得最佳的提取效果，供试品制备确定超声处理时间为45分钟。3.4溶媒用量的选择使用甲醇作为提取溶媒，用超声处理45分钟作为提取方法，分别加入甲醇20ml、30ml、40ml进行了提取，最后直接取续滤液作为供试品溶液，考察不同溶媒用量对测定结果的影响。结果表明，使用溶媒40ml时，峰面积值最大，但进行含量测定时经过取对数后，基本上和溶媒20ml时没有差别，所以将甲醇用量确定为20ml。3.5豆甾-7-烯醇为首次从银柴胡药材中分得，经熔点等理化常数和IR、NMR、UV、MS等光谱数据确定结构为豆甾-7-烯醇，经HPLC-ELSD归一化法测得其纯度为98%以上，符合含量测定的要求。3.6由于对照品豆甾-7-烯醇紫外为末端吸收，且未见文献报道豆甾-7-烯醇高效液相含量测定方法，所以本文采用蒸发光散射检测器检测，并建立了相应的含量测定条件，本方法快速、准确、可行。[参考文献][1]王英华,邢世瑞,刘明生等.野生银柴胡甾醇类成分研究.沈阳药学院学报，1993，10（2）134[2]陈功.银柴胡的生长期限和药理作用的关系.内蒙古药学，1991，10（3/4）：36[3]徐秀珍,王英华,伊桂兰.小叶黑柴胡中甾醇类成分的定量分析.宁夏医学院学报,2000,22(6):404-406[4]HombergE.E，SeherA．SterineinTrichosantheskirilowii．Phytochemistry，1977,16(2)288-290a图1豆甾-7-烯醇HPLC色谱图（a为豆甾-7-烯醇峰RT=26.615min）a图2银柴胡药材HPLC色谱图（a为豆甾-7-烯醇峰RT=26.347min）