转基因水稻讲义

前言：水稻是三大粮食作物之一，世界上近一半人口，都以水稻为主食，它是人类营养和能量摄入最重要的谷物，提供全世界五分之一以上热量消耗。概况：早在上世纪八十年代早期国际水稻生物技术的研发就在洛克斐勒基金的资助下开展。至今在水稻生物技术方面的专利超过三百项，涉及四百多个组织和机构。从1993年起，在美洲、欧洲、亚洲和澳洲的许多国家陆续开始了转基因水稻的田间试验。目前，已有6个转基因水稻品种获得了不同的批准认可，涉及种植、食用、饲用、进口和加工等方面。全球已培育出近50个转基因抗虫水稻品系，大部分均已进入田间试验阶段，鉴于其环境安全性及食品安全性，还未进行商业化种植，除了2004年伊朗批准抗虫转基因水稻的商业化种植。国内转基因水稻主要是华中农业大学张启发院士课题组在研究，其研发的抗虫转基因水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”于2009年8月获得农业部转基因生物安全证书，但是目前并没有获批进行商业化种植。除抗虫水稻外，一些药用或耐除草剂水稻陆续被批准进口或商业化应用。1998年起，美国批准VentraBioscience公司研发的转溶菌酶，乳铁蛋白、人血清白蛋白基因的3个药用转基因水稻的商业化种植。美国批准安万特公司的转bar基因耐除草剂水稻及先正达公司的黄金大米等。我们组通过上网查找资料、借阅图书馆书籍以及询问老师的方式对转基因水稻有了进一步的了解，现在和大家一起来揭开转基因水稻的神秘面纱。首先要介绍的是目前人类对转基因水稻研发所能达到的技术水平。技术比较成熟的有以下四种水稻：1、抗虫转基因水稻2、抗除草剂转基因水稻3、抗花粉过敏转基因水稻4、金稻技术还在研发中的水稻主要有抗逆性转基因水稻、高产和优质性状转基因水稻这两种。表格接下来介绍转基因水稻的工艺流程。我们知道，基因工程包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术主要是对外源基因的重组设计，分为以下几步：1、切（获取目的基因）2、接（构建基因表达载体）3、转（将目的基因导入受体细胞）4、增（扩增DNA重组分子）5、检（目的基因的检测与表达产物的测定）每一步具体的操作方法会根据供体、受体细胞的不同而改变，越具体到可以直接指导我们的实际操作的资料信息就越高精尖，目前我们的能力无法理清这些，所以只总结了一般可以选择的几种方法。第一步获取目的基因主要有三种方法，分别是鸟枪法（即直接分离目的基因）、人工合成法和从文库中获取。鸟枪法：cDNA法：将供体生物细胞的mRNA分离出来，利用反转录酶在体外合成cDNA，并将之克隆在受体细胞内，通过筛选获得含有目的基因编码序列的重组克隆，这就是cDNA法克隆蛋白质编码基因的基本原理。化学合成人工合成法：聚合酶链式反应（PCR）化学合成：如果目的基因的全序列是已知的，则可以利用化学合成法直接合成。目前已能利用DNA合成仪自动合成不超过50bp任何特定序列的寡聚核苷酸单链。目的基因的化学合成实质上是双链DNA的合成，可以分别直接合成其两条互补链，然后退火即可。对于大片段目的基因的合成，一次合成收率很低，故通常采用单链小片段DNA模板拼接的方法。聚合酶链式反应（PCR）：PCR扩增技术的本质是根据生物体DNA的复制原理在体外合成DNA。包括三步程序：1、将待扩增双链DNA加热变性，形成单链模板；（94℃）2、加入两种不同的单链DNA引物，并分别与两条单链DNA模板退火；（50℃）3、DNA聚合酶从两个引物的3’羟基端按照模板要求合成新生DNA链，构成一轮复制反应。（72℃）重复上次操作n次，理论上即可从1分子的双链DNA扩增到2的n次方个分子。（实际操作中不止一分子）从文库中获取：基因文库是指某一特定生物体全基因组的克隆集合。基因文库的构建就是将生物体的全基因组分成若干DNA片段，分别与载体DNA在体外拼接成重组分子，然后导入受体细胞中，形成一整套含有该生物体全基因组DNA片段的克隆，并将各克隆中的DNA片段按照其在细胞内染色体上的天然序列进行排序和整理，因此某一生物体的基因文库实质上就是一个基因银行。人们既可以通过基因文库的构建储存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，同时又能够在必须时从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。第二步中，在转基因水稻工艺流程中主要选用农杆菌Ti质粒作为载体。选定载体后要对其进行改造和构建，一般都要删除不必要区域，缩小它的相对分子量，同时采取措施避免它的扩散（对载体进行修饰），并且还要删除重复的酶切位点，加入标记基因等。在外源DNA片段与载体分子剪接前，还需要对连接位点做特殊的技术处理，以提高连接效率，所有这些操作均由一系列功能各异的工具酶来完成，其中一些常用的工具酶本身也已使用基因工程方法产生，如部分的限制性核酸内切酶、T4-DNA连接酶以及KlewnowDNA聚合酶等。最终的重组质粒的T-DNA区（即目的片段）包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因。第三步中，以经过改造的农杆菌Ti质粒为载体，通过寄主感染受体植物的途径将外源基因转入受体细胞。Ps:利用农杆菌感染植物细胞主要是依据它在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位的性质（受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物，从而使农杆菌移向这些细胞），然而起初这种方法只被用于双子叶植物中，这是因为单子叶植物如水稻，对农杆菌并不敏感，因此，利用它感染水稻时，我们要人为添加乙酰丁香酮，驱使农杆菌移向受伤细胞。通常选用叶盘法进行转化。第四步就是短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子使其整合到受体细胞的基因组中。第五步，是筛选和鉴定经转化处理的细胞，跟踪目的基因在转基因植物中的行为。主要是对报告基因、外源DNA及其在转录水平上的表达、外源表达蛋白的检测。报告基因由于其表达产物易于检测，在这里不赘述。对外源DNA的检测：点杂交、Southern杂交和PCR鉴定法点杂交是将提取DNA或RNA不经酶切,直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与探针进行杂交的技术。利用点杂交,可以初步鉴定转化体中是否有整和的外源基因。罗云波用DNA、RNA的点杂交技术对转基因植株进行鉴定,取得与田间表现一致的结果。但点杂交的特异性差,阳性植株还需进一步作Southern杂交验证。Southern杂交是将经酶切DNA转移到杂交膜上与探针杂交的技术。利用Southern杂交,可以确定外源基因在植物中的组织结构、外源DNA整和的位置及拷贝数、转基因植株F1世代外源基因的稳定性。研究发现,整合到植物基因组中的外源基因多以单拷贝形式存在,也有的是多拷贝的。Kitisvi的研究表明,整合到番茄基因组中的外源基因以1～4个拷贝出现,且整合到单一位点上,未发现转基因番茄表型的显著差异。在其它的研究中也发现外源基因以多拷贝的形式存在,一般在1～5拷贝之间变动,偶尔也有20～50拷贝。然而,多拷贝的转基因对植物来讲是不利的,它们可能通过异源配对,引起染色体构的变化,从而导致转基因的失活,也可能通过转录调控而引起转基因的失活。一般来讲,直接转基因法往往采用大量的DNA拷贝,容易获得较高比例的多拷贝转基因植株,而农杆菌介导的T—DNA转移出现多拷贝转基因植株的比例相对较低。Southern杂交可清除操作过程中的污染(如DNA分离及植物DNA分离过程中的交叉污染),以及转化愈伤胞间质粒残留所引起的假阳性信号,准确度高。但Southern杂交程序复杂,成本高,且对实验技术条件要求较高。PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法。能在几小时内使pg（皮克）水平的起始物达到ng（纳克）乃至μg（微克）水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。这项技术可用于转化后外源基因的鉴定和植物基因组的分析。武长剑等用PCR技术检测出转基因水稻中B.T基因和抗除草剂基因的存在。应用PCR法检测易出现假阳性,可用PCR-Southern杂交进一步验证。有时Northern杂交的信号弱,可用RT-PCR,将RNA反转录成cDNA,再与探针杂交,从而检测外源基因的表达[7]。利用RAPD-PCR技术,可以检测出对照植株与转化植株带型差异,还可用该技术检测不同代植株间基因组的稳定性及后代的分离。与Southern分析相比,PCR检测DNA用量少,操作简单,成本低,不需同位素即可完成。另外,PCR还能检测目的基因的完整性。但PCR检测也存在缺点,DNA插入植物基因组后易发生重排,即使载体上的抗性基因能表达,目的基因也未必完整地存在于转化体中,从而造成检测结果的误差。检测基因在转录水平上的表达：Northern杂交：是将试材RNA与探针杂交的技术,用于检测基因在转录水平上的表达。Northern杂交的主要原理是把变性RNA转移和固定在特定的薄膜上,用特定的DNA探针来检测RNA。Northern杂交与Southern杂交相比,更接近于性状表现,更有现实意义,被广泛用于转基因植株的检测。但RNA提取条件严格,在材料内含量不如DNA高,不适于大批量样品的检测。对外源表达蛋白的检测：Western杂交技术：是将蛋白质从SDS—PAGE胶中电转移至固相支持体上,然后对固定化蛋白质进行免疫学测定的方法。Western杂交灵敏度极高,能达到标准的固定相放射免疫水平。可以测出粗蛋白提取物中小于50ng抗原,在较纯的制剂中,可测出1～5ng抗原。Western杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果,能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现。一般来讲,Western杂交的结果与性状表现有直接关系。Southern、Northern、Western杂交分别从整合、转录、翻译水平检测外源基因的行为,说服力强。这些技术需要转膜、杂交,操作繁琐,费用高,不适合大批量样品的检测,可对转基因植株随机取样检测。Southern杂交特异性强,目前,对转基因植株中基因的存在、整合及稳定性一般都要通过Southern杂交来确定,是检测外源基因的最可靠的方法。Westhern杂交灵敏度高,能检测出蛋白质表达量,最具有现实意义。在实际工作中,研究者多把几种方法结合运用,以获得外源基因不同表达水平的信息。下游技术中，首先要对水稻愈伤组织进行诱导。方法如下：（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天；3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织1.消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒2分钟；2）倒去酒精，加入100ml20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30分钟；3)倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（MicroporeTMSurgicalTape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周然后培养农杆菌，使其感