辛伐他汀对骨髓基质干细胞特异性成骨分化基因表达的影响

中国组织工程研究第20卷第19期2016–05–06出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchMay6,2016Vol.20,No.19ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH2777·研究原著·刘昊，男，1982年生，河北省衡水市人，汉族，2008年华北煤炭医学院研究生部毕业，硕士，主治医师，主要从事骨与关节退行性疾病的研究。通讯作者：田发明，博士，副教授，硕士生导师，华北理工大学医学实验研究中心，河北省唐山市063000中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)19-02777-06稿件接受：2016-03-17，张岩1，刘家寅1，刘光源1，张克忠1，张国彬2，邢磊1，田发明3(华北理工大学，1附属医院，2研究生学院，3医学实验研究中心，河北省唐山市063000)引用本文：刘昊，张岩，刘家寅，刘光源，张克忠，张国彬，邢磊，田发明.辛伐他汀对骨髓基质干细胞特异性成骨分化基因表达的影响[J].中国组织工程研究，2016，20(19):2777-2782.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.006ORCID:0000-0001-7083-3380(田发明)文章快速阅读：文题释义：骨形态发生蛋白：是转化生长因子超家族成员之一，其中骨形态发生蛋白2是公认的骨髓基质干细胞成骨分化的关键蛋白，不仅可以促进成骨细胞及其前体细胞的增殖，而且能够促进成骨细胞的分化，是骨髓基质干细胞成骨分化中晚期表达的特异性标志蛋白，国外首次发现辛伐他汀的成骨潜能即是通过筛选发现辛伐他汀可以刺激骨形态发生蛋白2启动子活性。Ⅰ型胶原：由成骨细胞以原胶原的形式分泌，在骨骼与结缔组织中通过形成和保持骨架的完整性来发挥作用，在形成特定的细胞外微环境中也起到主要作用，而这些微环境对于维持细胞的完整性及传递细胞外信号起到关键作用。摘要背景：以往研究表明降脂类药物辛伐他汀具有促进体外培养骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的潜能，有望成为新型促成骨类药物，但干预不同时间点相应特异性成骨分化基因的表达是否有差异尚不得而知。目的：观察辛伐他汀体外刺激不同时间点大鼠骨髓基质干细胞骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原的表达。方法：取第1代骨髓基质干细胞分为两组，对照组加入成骨诱导培养基培养，辛伐他汀组在对照组基础上加入终浓度为10-7mol/L的辛伐他汀培养，干预第7天检测第3代细胞碱性磷酸酶的表达。取第4代骨髓基质干细胞分为两组，对照组加入成骨诱导培养基培养，辛伐他汀组在对照组基础上加入终浓度为10-7mol/L的辛伐他汀培养，干预12h和36h提取细胞RNA及蛋白，采用RealtimePCR和Westernblot法检测骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原的表达。结果与结论：①两组细胞均有碱性磷酸酶分泌，辛伐他汀组大鼠碱性磷酸酶阳性细胞比例显著高于对照组(P0.05)；②辛伐他汀组2个时间点骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原mRNA表达均显著高于对照组(P0.05)；③Westernblot法检测辛伐他汀组2个时间点骨形态发生蛋白2的表达均显著高于对照组(P0.05)；辛伐他汀组Ⅰ型胶原蛋白的表达于12h显著高于对照组(P0.05)，36h无显著差别；④以上结果提示，辛伐他汀可以促进大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化晚期特异性标志蛋白骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原的表达，药物刺激12h较36h作用更显著。关键词：干细胞；骨髓基质干细胞；辛伐他汀；碱性磷酸酶；骨形态发生蛋白2；Ⅰ型胶原；河北省自然科学基金主题词：骨髓；骨髓干细胞；间质干细胞；斯伐他汀；骨形态发生蛋白质类；胶原Ⅰ型；组织工程辛伐他汀体外刺激不同时间点骨髓基质干细胞骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原的表达第4代大鼠骨髓基质干细胞对照组加入成骨诱导培养基培养12h和36h辛伐他汀组在对照组基础上加入终浓度为10-7mol/L的辛伐他汀培养基培养12h和36hRealtimePCR和Westernblot分析骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原蛋mRNA的表达，结果显示药物刺激12h较36h作用更显著刘昊，等.辛伐他汀对骨髓基质干细胞特异性成骨分化基因表达的影响P.O.Box10002,Shenyang110180:TianFa-ming,M.D.,Associateprofessor,Master’ssupervisor,MedicalResearchCenterofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,HebeiProvince,China基金资助：河北省高等学校科学研究计划(QN20131007)；河北省自然科学基金(H2013209255)；唐山市老年医学重点实验室资助项目(14140221B)SimvastatineffectsontheexpressionsofspecificosteogenicgenesinbonemarrowstromalstemcellsLiuHao1,ZhangYan1,LiuJia-yin1,LiuGuang-yuan1,ZhangKe-zhong1,ZhangGuo-bin2,XingLei1,TianFa-ming3(1AffiliatedHospital,2GraduateSchool,3MedicalResearchCenter,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,HebeiProvince,China)AbstractBACKGROUND:Previousstudieshavedemonstratedthatsimvastatinthatcanpromoteosteogenicdifferentiationofbonemarrowstromalstemcellsinvitro,islikelytobeanewosteogenicdrug.Whileitisstillunknownwhetherthereistime-dependentstimulationofsimvastatinontheexpressionsofbonemorphogeneticprotein2andcollagentypeI.OBJECTIVE:Toinvestigatetheexpressionsofbonemorphogeneticprotein2andcollagentypeIinratbonemarrowstromalstemcellsinvitrostimulatedbysimvastatinatdifferenttimepoints.METHODS:Passage1bonemarrowstromalcellsweredividedintocontrolandsimvastatingroup,followedbyculturedinosteogenicdifferetiationmediumwithoruithout10-7mol/Lsimvastatin.After7-dayintervention,expressionofalkalinephosphatasewasdetectedinpassage3cells.Passage4cellsweredividedandculturedasdescribedabove,andafterwards,RNAandproteinswereextractedat12and36hourstodetecttheexpressionsofbonemorphogeneticprotein2andcollagentypeIusingreal-timePCRandwesternblotassay.RESULTSANDCONCLUSION:Bothtwogroupscouldexpressalkalinephosphatase,whiletherateofpositivecellssignificantlyincreasedinthesimvastatingroupcomparedwiththecontrolgroup(P0.05);at12and36hoursafterintervention,mRNAexpressionsofbonemorphogeneticprotein2andcollagentypeIinthesimvastatingroupweresignificantlyhigherthanthoseinthecontrolgroup(P0.05).Besides,westernblotassayshowed:atboth12and36hours,simvastatinsignificantlyenhancedtheexpressionofbonemorphometricprotein2,whiletheexpressionofcollagentypeIsignificantlyincreasedat12hours(P0.05),butnotat36hours.Inconclusion,simvastatincanpromotetheexpressionsofbonemorphometricprotein2andcollagentypeIinratbonemarrowstromalcells,withmorefavorableoutcomesafter12-hourtreatment.Subjectheadings:BoneMarrow;MesenchymalStemCells;Simvastatin;BoneMorphogeneticProteins;CollagenTypeI;TissueEngineeringFunding:theNaturalScienceFoundationofHebei,No.H2013209255;theScientificResearchProjectofHebeiUniversitiesandColleges,No.QN20131007;TangshanKeyLaboratoryProjectofGeriatricMedicine,No.14140221BCitethisarticle:LiuH,ZhangY,LiuJY,LiuGY,ZhangKZ,ZhangGB,XingL,TianFM.Simvastatineffectsontheexpressionsofspecificosteogenicgenesinbonemarrowstromalstemcells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(19):2777-2782.0引言Introduction他汀类药物作为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaricacid，HMG-CoA)还原酶抑制剂，能够抑制胆固醇生物合成、减少血清胆固醇浓度，进而降低心脏疾病的发生率，一直应用于心血管疾病的治疗。辛伐他汀作为他汀类药物的一种，因表现出对炎症、缺血再灌注损伤、癌症、骨丢失等降脂以外的潜在治疗作用而备受关注[1-7]，其中促进骨形成的作用已成为骨组织工程、骨代谢等相关领域研究的热点之一。课题组在前期研究中发现辛伐他汀体外刺激骨髓基质干细胞可明显