附7禽流感实验室检测技术方案

1附7禽流感实验室检测技术方案一、实验室网络设置实验室网络由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心和省级流感实验室两级组成。二、实验室条件及生物安全操作的要求1．省级流感实验室实验条件及生物安全的操作要求（1）实验生物安全要求：安全Ⅱ级+（BSL-2级+）或安全Ⅲ级（BSL-3级）。（2）特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测、血清学检测中用到的血凝抑制实验（HI）可以在安全Ⅱ级+（BSL-2级+）实验室里操作。（3）特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测在安全Ⅱ级+（BSL-2级+）实验室的生物安全柜里提取病毒的核酸，进行病毒核酸检测的实验室要求请参照国家有关核酸检测要求的规定。（4）微量中和实验、特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测阳性的采样标本的病毒分离、尸检标本的检测必须在安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室里操作。（5）省级流感实验室实验条件：具备进行禽流感相关临床标本初筛所需的生物安全柜、离心机、PCR仪、电泳仪、紫外线检测仪等配套设备。2．国家流感中心实验生物安全要求：生物安全Ⅱ级+（BSL-2级+）和生物安全Ⅲ2级（BSL-3级）实验室。3．省级流感实验室职责（1）禽流感标本特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测；（2）禽流感H5的血清学检测工作;（3）特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒分离必须在生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室；（4）没有生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室的，将标本送国家流感中心做病毒的分离工作。4．国家流感中心实验室职责（1）国家流感中心设立在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感室；（2）对各省报告的禽流感疑似病例或确诊病例进行复核、确认；（3）对不具备禽流感病毒分离条件的省份送检标本的检测、分离和确认；（4）对需要做微量中和实验的血清标本进行微量中和试验；（5）对各省级实验室检测人员的培训；（6）对各省级流感实验室的质量控制。三、原始标本采集1．标本采集人员医疗机构的医生、护士或当地疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照《禽流感职业暴露人员防护指导原则》做好个人防护。32．标本采集种类和时限（1）采集标本的种类：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物。（2）采集标本时间：1）咽、鼻拭子或含漱液在发病的头3天采集；2）急性期血清在发病后7天内采集，恢复期血清在发病后2-4周采集；3）尸检标本尸检时采集。3．标本的运送：所有采集的标本应在医院采集时立即分装，一式二份，其中一份单独保存，以备复核。采集的标本若不能在24小时内送达，则应尽快在－70℃以下保存。无－70℃条件的需在－20℃冰箱短时间暂存，并尽快联系递送标本。4．标本采集的方法：详见国标《流行性感冒诊断标准及处理原则》四、送流感中心的标本包装、运送与接收1．标本的包装（1）标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧。（2）将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一份标本。（3）直接在塑料管上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、姓名，同时也将标本有关信息填在禽流感人体标本送检登记表，4连同塑料管用另一塑料袋密封。（4）将装标本的密封袋放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密封。若将进行病毒分离，可将密封好的装有标本的容器直接放入液氮运输罐内运输。所有容器必须印有生物危险标识。2．标本运送（1）航空或铁路运送。（2）专人专车运送：主要用于近距离样品运送。3．标本的接收（1）各省级中心实验室应公布标本接收联系方式，并实行24小时标本接收制；（2）国家实验室标本接收：需送国家流感中心实验室检测的原始标本、病毒分离物、可疑阳性标本、血清等，填写标本送检登记表，在低温保存条件下，于24小时内送至中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感中心进行复核。国家流感中心标本接收联系方式为：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，地址：北京市宣武区迎新街100号，联系人：郭元吉、王敏，联系电话：[phone]，传真：[phone]。五、标本检测方法1．禽H5病毒核酸检测：5材料：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等。方法：RT-PCR，用于禽H5亚型流感病毒的快速检测、测序及排除工作试剂：特异性H5及甲型流感病毒的引物、病毒RNA提取试剂盒、逆转录酶、TaqDNA聚合酶等试剂,建议使用德国QIAGEN的RneasyMiniKit(病毒核酸提取)和QIAquickGelExtractionKit（PCR产物纯化）产品。2．病毒分离及鉴定：材料:疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等。方法：采用鸡胚和MDCK细胞分离方法，血凝及血凝抑制试验（HAI）具体方法详见国标《流行性感冒诊断标准及处理原则》。经特异性H5RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒分离及鉴定工作必须在安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室里操作。试剂：鸡胚接种采用SPF鸡胚，MDCK细胞等。3．疑似病例的血清学检测：材料：疑似病例的急性期和恢复期的双份血清方法：血凝抑制实验具体方法详见国标《流行性感冒诊断标准及处理原则》。试剂：H5灭活病毒。4．微量中和试验6材料：疑似病例的急性期和恢复期的双份血清试剂：H5活病毒，必须在生物安全Ⅲ级(BSL-3级)实验室里操作。六、检测结果的确认以下情况的原始标本及分离物送国家流感中心检测、复核、确认。1．标本分离物血凝试验（HA）阳性，同时H5血凝抑制试验（HI）阴性，H5的RT-PCR检测阳性。2．标本分离物血凝试验（HA）阳性，同时H5血凝抑制试验（HI）阳性或H5的RT-PCR检测阳性。3．标本分离物血凝试验（HA）阳性，同时H5的RT-PCR检测阳性。4．病人恢复期血清比急性期血清的H5抗体有4倍或以上增高。5．标本分离物血凝试验（HA）阳性，H5血凝抑制试验阴性，并已排除了是当前流行的甲、乙型毒株的可能。七、检测结果报告一般情况下,实验室收到的样本立即进行实验，并于收到标本后24小时内出具RT-PCR检测报告，3-5天出具病毒分离培养结果，于分离到病毒后的3-5天出具流感病毒的血凝抑制结果，微量中和实验须3-5天完成。当实验过程中出现不可预测情况或意外事件，影响了按时出具报告时，应及时报告和说明。7附件ICSGB中华人民共和国国家标准GB流行性感冒诊断标准及处理原则Diagnosticcriteriaandprinciplesofmanagementofinfluenza(报批稿)8发布实施国家质量技术监督局发布目次前言――――――――――――――――――――――――――――――――31范围―――――――――――――――――――――――――――――――42诊断原则―――――――――――――――――――――――――――――43诊断标准―――――――――――――――――――――――――――――44处理原则―――――――――――――――――――――――――――――5附录A（规范附录）病原学诊断方法―――――――――――――――――5附录B（规范附录）血清学诊断方法―――――――――――――――――7附录C（资料附录）红细胞凝集抑制试验―――――――――――――――8附录D（资料附录）神经氨酸酶活性抑制试验――――――――――――――12附录E（资料附录）对流免疫电泳及琼脂凝胶沉淀试验―――――――――16附录F（资料附录）流感快速诊断方法――――――――――――――――199GB前言流行性感冒(简称流感)为一种人、禽、畜共患的病毒性急性传染病。流感病毒根据其核蛋白（NP）和M1蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常以流行形式出现，能引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，并也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒能引起流感局部暴发，不会造成世界性流感大流行，至今除在人以外还能在海豹中分离到它。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，它也能感染猪。流感常突然发生，迅速蔓延，波及面广，发病率和死亡率均高但病死率低。至今仍严重威胁着人的身心健康，甚至夺走性命，常给国民经济带来巨大损失，我国被世界公认为是流感的多发地。受卫生部传染病防治监督管理办公室委托，由郭元吉同志负责对流行性感冒诊断标准及处理原则GB15944-1995进行修改，其目的：把过时的，不适用的删除，加入适用新的内容。具体修改之处如下：1．前言中强调了流感为一种人、禽、畜共患病，同时考虑到禽流感病毒在人群中可引起的流感，其传播途径不清楚，故把传播途径删除。2．诊断原则中增加了或从患者采集的标本中查到病毒颗粒特异的蛋白或特异核酸成分。3．实验室诊断中去掉白细胞计数指标，因该指标不能做为流感的试验诊断依据。4．附录A。病毒分离中，因甲型流感病毒“O”相特性的出现，故强调了细胞系统分离病毒的重要性；在HA测定中不应用鸡红细胞，而应用豚鼠或人的红细胞。5．把B3神经氨酸酶抑制试验改为附录D。把B3中不规范的一律改为当今国际上统一使用的方法。6．删除B2已过时，操作复杂，易受实验条件影响的“型特异性补体结合试验，改为附录E“对流免疫电泳”，同时考虑到对禽血清抗体测定时，常用琼脂凝胶沉淀试验。因此，在附录E中也加入后者的内容。7．快速诊断为附录C改为附录F。同时加入FLUOIAKit和RT-PCR法。本标准的附录A和B是规范的附录。本标准的附录C-F是资料的附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所本标准主要修订人：郭元吉本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。10中华人民共和国国家标准流行性感冒诊断标准及处理原则GBDiagnosticcriteriaandprinciplesofmanagementofinfluenza1范围本标准规定了流感的诊断标准及处理原则。本标准适用于各级医疗、卫生、保健机构和人员。对流感的诊断，报告和处理的应用。2诊断原则流感流行时一般可根据临床症状，结合流行病学资料可对患者作出初步诊断。如确诊则需要病毒分离阳性或病人双份血清抗体测定，其恢复期抗体滴度较急性期增高4倍或以上，或从患者采集的标本中查到病毒粒特异的蛋白或特异核酸成分。3诊断标准3．1流行病学资料在流行季节一个单位或地区同时出现大量上呼吸道感染病人；或近期内本地区或邻近地区上呼吸道感染病人明显增多；或医院门诊呼吸道感染病人明显增多；或挨家挨户上呼吸道感染患者明显增多。3．2临床症状3．2．1出现急起畏寒、高热、头痛、头晕、浑身酸痛、乏力等中毒症状。3．2．2可伴有咽痛、干咳、流鼻涕等症状。3．2．3少数病例有食欲减退、伴有腹痛，腹胀、呕吐和腹泻等消化道症状。3．3实验室诊断113．3．1从病人鼻咽分泌物中可分离到流感病毒（见附录A）。3．3．2患者恢复期血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期高4倍或以上（见附录B）。3．3．3在患者呼吸道上皮细胞查到流感病毒颗粒特异的蛋白成份或特异的核酸（见附录F）。3．3．4采集标本经敏感细胞将病毒增殖一代后，查到流感病毒粒特异的蛋白或特异的核酸（见附录F）。3．4病例分类3．4．1疑似病例（流感样病例）具备腋下体温≥38℃，加上其他临床症状两项或以上，或加3、1及胃肠道症状两项或以上。3．4．2确诊病例疑似病例加3.3.1或3.3.2或3.3.3或3.3.4。4.处理原则4.1早期隔离病人,服抗流感病毒药物,对症治疗和防并发症.早期发现病人,早期隔离(因地制宜,就地适当隔离)病人是重要的措施.对病人治疗一般采用对症疗法,发病早期(48小时内)可服用抗流感病毒药物,严重患者如严重肺炎,呼吸极度困难,高热不退等需住院治疗.防治并发症主要应防止流感病毒性肺炎和细菌性肺炎,尤其对年迈体衰者或伴有心血管,糖