陕南水牛微卫星DNA遗传多样性研究

1陕南水牛微卫星DNA遗传多样性研究王斌1,2，昝林森1,3*，杨彦杰4，钟昕1，黄磊1，王洪宝1,3（1西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100；2汉中职业技术学院农林系，陕西汉中723000；3国家肉牛改良中心，中国杨凌7121004；4河南师范大学生命科学学院，河南新乡453007）[摘要]【目的】分析4个陕南水牛群体的遗传多样性，为陕南水牛品种的资源保护和开发利用提供支持。【方法】利用10对微卫星引物，采用PCR扩增和非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳技术，对192头陕南水牛（分别采自城固、南郑、宁强和汉滨4个群体，每群体48头）进行了遗传多样性检测，统计了各群体的等位基因频率、等位基因数、有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（H）、各群体间的奈氏标准遗传距离及多态信息含量（PIC），根据遗传距离进行了聚类分析。【结果】4个陕南水牛群体在10个微卫星位点共发现104个等位基因，其中有8个特有等位基因，等位基因频率为0.0052～0.3490，总群体各位点平均有效等位基因数为4.0174～13.1469；10个微卫星位点平均多态信息含量为0.7007～0.8932，均为高度多态；平均杂合度为0.7550～0.9288。聚类分析结果显示，城固群体与南郑群体首先聚在一起，然后依次同宁强、汉滨水牛群体聚在一起。【结论】10对微卫星标记可作为有效的遗传标记用于陕南水牛遗传多样性的分析；陕南水牛群体变异程度多样性丰富，选育程度较低；聚类分析结果符合陕南水牛的地理分布格局和产区的自然环境，4个群体之间遗传差异较小,遗传一致性程度较大。[关键词]陕南水牛；微卫星；遗传多样性[中图分类号][文献标识码]A[文章编号]StudyongeneticdiversityofmicrosatelliteDNAinShaannanbuffaloWANGBin1,2,ZANLin-sen1,3,YANGYan-jie4,ZHONGXin1,HUANGLei1,WANGHong-bao1,3(1CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA&FUniversity，Yangling，Shaanxi712100,China；2A&FDepartment，HanzhongVocationandTechnologyCollege，Hanzhong,Shaanxi723000,China；3NationalBeefCattleImprovementCenterinChina,Yangling,Shaanxi712100,China;4CollegeofLifeSciences,HenanNormalUniversity，Xinxiang，Henan453007,China)Abstract:【Objective】ToanalysegeneticdiversityoffourlandracesbuffaloinsouthernShaanxiandtoprovidesupportfortheprotectionandutilizationofresourcesofbuffalospeciesinsouthernShaanxi.【Method】192ShaannanBuffalo（wereselectedfromChenggu,Nanzheng,NingqiangandHanbin）wereusedtodetectthegeneticdiversity,andcountedallelefrequencyofeachgroup,numberofalleles,effectivenumberofalleles(Ne),heterozygosity(H),betweengroupsNei'sstandardgeneticdistanceandthepolymorphicinformationcontent(PIC),analysizegeneticdistancethroughclusteranalysis.【Result】Theresultsindicatethatthereare104allelesand8alleles-specificat10microsatellitelocusin4localbuffalopopulations.Theallelefrequencies;averageeffectivenumberofallelesandtheaveragepolymorphicinformationcontentrangingfrom0.0052－0.3490;4.0174－13.1469and0.7007－0.8932,meanwhile,theaverageheterozygosityrangefrom0.7550－[收稿日期]2010-01-17[基金项目]国家“十一五”科技支撑计划项目（2006BAD14B07）；西北农林科技大学拔尖人才支持计划项目[作者简介]王斌（1979—）男，陕西城固人，讲师，硕士，主要从事生物技术与家畜育种研究。E－mail：[e-mail][通信作者]昝林森（1963—），陕西扶风人，教授，博士生导师，主要从事牛遗传育种与繁殖研究。E－mail：[e-mail]tChenggugroupsfirstofalltogetherwithNanzheng,followedwithNingqiang,Hanbin.【Conclution】10pairsofmicrosatellitemarkerscanbeusedasaneffectivegeneticmarkerfortheanalysisofthegeneticdiversityofbuffaloinsouthernShaanxi.TherearerichdiversityofvariationinShaannanbuffalo.AnanlysisofclusteringshowedthattheseconsistentwiththegeographicaldistributionpatternsandnaturalenvironmentofShaananBuffalo.TherearebasicallysameatgeneticbasisbetweenFourlocalgroups(ChengguNanzhengNingqiangandHanbin)Keywords：Shaannanbuffalo；Microsatellite；geneticdiversity微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)，又称短串联重复(Shorttandemrepeats，STR)或简单重复序列(Simplesequencerepeat，SSR)，是以1～6个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的重复序列[1]，如（TG）n、（AAT）n、（GATA）n等。微卫星广泛存在于各种真核生物的基因组中，而且分布比较均匀，平均每10kb的DNA序列中就会出现1个微卫星序列[2]。微卫星具有数量大、分布广而均匀、多态性丰富、共显性遗传以及分析方法简便、快捷、结果重复性好等优点，目前已在动植物的基因组作图、群体遗传变异分析、群体起源分析、亲子鉴定、QTL检测与定位等研究中得到广泛应用[3-5]。陕南水牛是主产于汉中和安康盆地的地方水牛品种，主要分布于汉中、安康两市的十三县（区）[6],具有体质健壮、力大、役用性能好、耐粗饲、耐苦、耐劳、抗病性强等特点，有一定的乳、肉生产潜力，是适宜于陕南水田密集区饲养的一个重要畜种资源。目前关于陕南水牛分子水平遗传多样性的研究还比较少。张伟[7]对6个水牛类群54个个体（其中6头为陕南水牛）的mtDNAD-loop区全序列进行测序分析，从母系角度研究了中国水牛的起源。齐国强等[8]对9头陕南水牛的mtDNAD-loop区序列(930bp左右)、类群之间的系统进化关系以及遗传多样性进行了分析。张毅[9]利用线粒体D-loop区序列和Y染色体SNP两类标记,分别从母系和父系两个方面，对包括陕南水牛在内的水牛群体进行了遗传多样性和起源驯化分析。截止目前，尚未见有关利用微卫星遗传标记从分子水平对陕南水牛进行遗传多样性和发生关系的研究报道。为此，本研究利用10个微卫星位点，对陕南水牛进行遗传学检测，初步探讨其遗传多样性和遗传分化关系，以期为陕南水牛在中国水牛中系统地位的确定及进一步开展陕南水牛品种资源保护和开发利用工作提供参考。1材料与方法1.1材料从陕南水牛中心产区城固（CG）、南郑（NZ）、宁强（NQ）、汉滨（HB）4地分别选择48头品种特征明显、没有与国外水牛杂交历史，并且个体间在3代或2代内没有血缘关系的个体，颈静脉采血（10mL/头），ACD抗凝（V(ACD)︰V(血液)＝1︰6），轻轻晃动摇匀，置于冰盒带回实验室，于－80℃保存。1.2主要试剂蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、10×Buffer、dNTPs、DNAMarker，均购自北京鼎国生物工程公司。分子量标记物pBR322/MspⅠ，由北京华美生物公司提供。1.3陕南水牛基因组DNA的制备参照《分子克隆实验指南》[10]，采用传统的酚、氯仿抽提法并略作改进，提取陕南水牛血样基因组DNA。将DNA用TE缓冲液溶解，然后用15g/L琼脂糖进行凝胶电泳检测，3并用紫外分光光度计测定其浓度，于－80℃保存备用。1.4PCR扩增从2004年国际动物遗传学会（ISAG）和联合国粮农组织（FAO），推荐的用于家养水牛遗传多样性研究的微卫星引物中，筛选出10对引物（表1）用于试验，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为15μL：10×Buffer(含15mmol/LMg2+)1.5μL，2mmol/LdNTPs1.5μL，2U/μLTaqDNA聚合酶0.25μL，10pmol/μL上、下游引物各0.6μL，模板DNA(50ng/μL)1.0μL，ddH2O10.15μL。PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃30s，55～65.8℃（退火温度因引物不同而异，表1）退火35s，72℃30s，32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。表110对微卫星引物的PCR条件Table1PCRrectionconditionsof10pairsprimerofmicrosatellite位点Locus染色体位置Chromosomalposition引物序列（5’→3’）Primersequence退火温度/℃Annealingtemeperature产物大小/bpProductsCSSM03317CACTGTGAATGCATGTGTGTGAGC65.8155～209CCCATGATAAGAGTGCAGATGACTILSTS01211TCTACCACCGATACAGATGG61.1109～125GAAGTAGGTAGTGCTGGAGGILSTS03124AATTCTAGGTGAACAGCAGC62.3276～304AAGACATACTCTCAGACTCCILSTS06820TGCAAAGAGTTGGATGGGGC61.5146～212AAGGTTGCTGCCTCATATCCHEL1311TAAGGACTTGAGATAAGGAG55.0137～193CCATCTACCTCCATCTTAACILSTS06115AAATTATAGGGGCCATACGG55.0133～171TGGCCTACCCTACCATTTCCILSTS09521GAAAGATGTTGCTAGTGGGG58.6207～247ATTCTCCTGTGAACCTCTCCCSSMO191TTGTCAGCAACTTCTTGTATCTTT59.9137～171TGTTTTAAGCCACCCAATTATTTGCSSM03627GGATAACTCAACCA