选修3-12基因工程的基本操作程序

专题1基因工程1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取1、目的基因：2、获取目的基因的常用方法？（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成主要是指编码蛋白质的基因（1）从基因文库中获取目的基因基因文库基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切割多个DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库含有一种生物的全部基因某种生物某发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库逆转录酶DNA聚合酶只包含了一种生物的部分基因cDNA文库的构建P10基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以补充知识：真核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片段，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子外显子内含子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子：外显子：补充知识：真核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子补充知识：原核细胞的基因结构与真核细胞的基因结构相似，但编码区是连续的，都能够编码蛋白质，没有外显子和内含子之分。编码区外显子内含子转录、加工修饰mRNAP10基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以PCR全称为多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。②原理：DNA复制①概念：③前提条件：④原料：⑤方式：⑥结果：（2）利用PCR技术扩增目的基因过程：变性、退火、延伸三步曲1、变性：加热至90～95℃，双链DNA(含目的基因）解链成为两条单链DNA；2、退火：冷却至55～60℃，引物与单链DNA结合；3、延伸：加热至70～75℃，单链DNA在DNA聚合酶（Taq酶）作用下作为模板链合成与其互补的新DNA链。（2）利用PCR技术扩增目的基因Taq酶是从水生栖热菌Taq中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。对于PCR的应用有里程碑的意义，PCR循环包括变性（90°C左右）、退火（50°C左右）、延伸（70°C左右），每一步对温度的要求都不一样，多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷。同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点。②原理：DNA复制①概念：③前提条件：已知基因的核苷酸序列，以便根据这段序列合成引物。④原料：⑤方式：⑥结果：获得大量目的基因模板DNA、引物、Taq酶（热稳定DNA聚合酶）、四种脱氧核苷酸指数方式扩增，即2n为扩增循环的次数PCR全称为多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。（2）利用PCR技术扩增目的基因如果基因比较小，核苷酸序列又知道，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。DNA合成仪（3）化学方法人工合成目的基因从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）1、目的：(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；(2)使目的基因能够表达和发挥作用。2、基因表达载体的组成成分目的基因质粒（复制原点、标记基因）启动子终止子启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片段，能终止mRNA的转录。标记基因：其作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。①用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量_____________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶怎样构建基因表达载体？②用_______________切断目的基因，使其产生__________________。质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种过程:怎样把目的基因和质粒拼接起来？答：用同种限制酶分别切割目的基因和质粒，使之露出相同的粘性末端，再加入DNA连接酶。①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。③目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。④启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。⑤构建基因表达载体时，用同一种限制酶切割目的基因和载体，由于目的基因两端和载体的两端具有相同的末端，在DNA连接酶的作用下能够产生3种结果，即：1.目的基因的两端结合形成的环状DNA2.载体的两端重新结合形成的环状DNA3.目的基因与载体结合形成的目的基因表达载体PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子三、将目的基因导入受体细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法(1)农杆菌转化法②原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。①特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。(2)基因枪法适用于单子叶植物(3)花粉管通道法我国科学家独创，植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。抗虫棉2.将目的基因导入动物细胞(1)方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）答：受精卵具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞表达。(2)操作程序含目的基因的表达载体受精卵显微注射含有目的基因的受精卵培养新性状动物早期胚胎移植雌性动物输卵管或子宫发育（转基因动物）(1)常用法：Ca2+处理(2)常用菌：大肠杆菌(3)微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少(4)过程：大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？答：用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性。Ca2+处理受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞归纳：将目的基因导入受体细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）A.将毒素蛋白注射到受精卵中B.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中四、目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体上的DNA是否插入了目的基因分子水平检测②检测目的基因是否转录出mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质个体水平鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定方法——DNA分子杂交方法——分子杂交方法——抗原-抗体杂交1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①方法：DNA分子杂交（DNA与DNA杂交）基因探针：是一小段单链的DNA或RNA，带有放射性同位素标记，能够与目的基因的一条链发生碱基互补配对。③过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNA；B.对含有能够与目的基因进行碱基互补配对的一条DNA单链作放射性同位素标记，以此做探针；C.使探针和转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带，表明染色体已插入染色体DNA中。2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质①方法:①方法:抗原-抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA。检测抗虫棉是否翻译出毒蛋白：从苏云金杆菌中提取毒蛋白，注入某种生物体内，从动物的血清中分离相应抗体，并用荧光标记该抗体。然后用标记的抗体与抗虫棉的细胞提取液混合，若出现杂交带，则表明抗虫基因已在棉花细胞中表达。分子杂交（DNA与mRNA杂交）——抗虫鉴定、抗病鉴定等例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。个体水平鉴定类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交（DNA和mRNA之间）是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定等归纳：目的基因的检测与鉴定归纳:基因工程的基本操作程序1、获取目的基因从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、化学方法人工合成2、构建基因表达载体目的基因、质粒（复制原点、标记基因）、启动子、终止子3、将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法（植物）、Ca+处理法（微生物）、显微注射法（动物）4、目的基因的检测与鉴定分子水平检测：是否插入、转录、翻译个体水平鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定等提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①DNA分子杂交原理（了解）：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用探针和转基因生物的DNA杂交时候，如