贺氏三通法对IL-18和IL-1含量的影响

1“贺氏三通法”对脑缺血再灌注模型大鼠血清IL-18和IL-1水平的影响程金莲1张露芬2王麟鹏1牛晓暐1李敬道1宣雅波1*国家中医药管理局“中医临床诊疗技术整理与研究项目”（2000ZL03）作者单位：1.100010，首都医科大学附属北京中医医院针灸科2.100029，北京中医药大学针灸学院综合实验室[摘要]目的：观察“贺氏三通法”对脑缺血再灌注模型大鼠血清白细胞介素-18（IL-18）及白细胞介素-1（IL-1）水平的影响。方法：将SD成年雄性大鼠随机分为假手术组（8只）、模型对照组（8只）、针刺组（24只）、药物组（16只）。采用线栓法制备脑缺血再灌注大鼠模型。造模成功后，针刺组分别于3h、6h、48h（每时段8只）予“贺氏三通法”针刺，药物组于5h、48h予香丹注射液腹腔内注射。模型制备成功后72h取材，采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清IL-18，放射免疫法检测血清IL-1含量。结果：模型对照组IL-18和IL-1水平较假手术组明显增高，差异有统计学意义（均P0.01）；48h针刺组IL-18水平较模型对照组明显降低，差异有统计学意义（P0.05）；6h、48h针刺组IL-1水平均较模型对照组降低，差异有统计学意义（均P0.01）；针刺组与相应时间介入的药物对照组比较均无显著差异（p0.05）。结论：“贺氏三通法”可改善脑缺血再灌注后血清IL-18和IL-1水平，提示“贺氏三通法”可能通过调节IL-1、IL-18的紊乱，参与对脑缺血再灌注脑损伤的保护机制。[关键词]贺氏三通法；针灸；脑缺血再灌注；血清IL-18；血清IL-1；实验研究EffectofAcupunctureat“He’santongMethod”withDifferentStimulationTimeonSerumInterleukin-18andInterleukin-1ContentsinCerebralIschmiaReperfusionInjuryrats“贺氏三通法”是贺普仁教授在50多年的医疗实践中，以“病多气滞”的病机学说和“法用三通”针灸治则为基础创立的针灸治疗体系，应用于缺血性脑卒中各期疗效显著[1][2]。本研究通过脑缺血再灌注模型大鼠，观察不同时间针刺对血清白细胞介素-18（IL-18）及白细胞介素-1（IL-1）含量的影响，研究IL-18在针灸抗炎免疫方面的调节作用，探讨“贺氏三通法”对缺血性脑卒中的作用机制。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物与分组：SD成年雄性大鼠，清洁级，体重210-240g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SYXK（京）2006-0012。饲养于北京中医药大学针灸学院综合实验室动物房，动物房符合SPF屏障系统。采取随机抽签的方法分为假手术组（8只）、模型对照组（8只）、针刺组（24只）、药物组（16只）。根据干预时间的不同，针刺组中分为3h针刺组（8只）、6h针刺组（8只）、48h针刺组（8只）；药物组分为5h药物组（8只）、48h药物组（8只）。1.1.2针具与药物：选用华佗牌无菌针灸针（苏州医疗用品有限公司）φ25×25mm、贺氏细火针φ50×25mm、小号三棱针（苏州医疗用品有限公司）。对照药物香丹注射液（北京双鹤高科天然药物有限责任公司，批号：307213.1）。1.2.3试剂：大鼠IL-18定量EIA试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司，IL-1放免测定试剂盒购自北京华英生物技术研究所。1.2.4仪器设备：低温离心机（ZK380型，德国产）、全自动酶标仪（MultiskanMK3型，芬兰产）、γ射线计数仪（GC-911型，中国科技大学仪器厂）E-mail:[e-mail]，电话：[phone]方法1.2.1模型制备：参照Zealonga线拴法[3]制备模型。模型成功的标准：（1）对侧Hornor征，（2）提尾时对侧前肢内收屈曲，（3）爬行时向对侧倾倒或按顺时针方向转圈。模型不成功者均被剔除，随机补充，保证每组8只。1.2.2实验方法：模型对照组造模后不予处理；针刺组在造模成功后分别按3h、6h、48h分组针刺，每日1次。药物组在造模成功后分别按5h、48h分组，以15mL·100g-1予香丹注射液腹腔内注射，每日1次。1.2.3针刺方法：参照《实验针灸学》[4]选取百会、十宣、曲泽、委中穴。3h、6h针刺组的前2次针刺（即造模后36h内）予“贺氏三通法”之强通法，在上述诸穴行三棱针放血，出血量至少1滴，每日1次；3h、6h针刺组的第3次针刺和48h针刺组予“贺氏三通法”之温通法和微通法，在上述诸穴以火针点刺后行毫针刺，留针20min。1.3.指标检测1.3.1标本采集：各组大鼠均在造模成功72h后行断头取血5mL，室温放置100min，-4℃离心3000r/min15min，分离血清，-70℃保存。1.3.2指标检测：采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清IL-18，采用放射免疫法测定血清IL-1含量。1.4统计学方法采用SPSS10.0统计软件，计量资料采用均数±标准差（）表示，各组组间差异采用单因素方差分析，以P0.05作为具有显著性差异的标准。2结果2.1各组大鼠血清IL-18水平比较模型对照组IL-18水平较假手术组明显增高，差异有统计学意义（P0.01）。3h、6h针刺组和5h药物组的IL-18水平均不同程度低于模型对照组，差异无统计学意义（均P0.05），48h针刺组IL-18水平较模型对照组明显降低，差异有统计学意义（P0.05），48h药物组有降低趋势，差异无统计学意义（P0.05），48h药物组IL-18水平较48h针刺组略高，但无统计学意义（P0.05）。3h与6h针刺组比较，IL-18水平差异无统计学意义（P0.05），48h针刺组与6h针刺组比较，IL-18水平明显降低，差异有统计学意义（P0.05）。见表1。2.2各组大鼠血清IL-1水平比较模型对照组IL-1水平较假手术组明显增高，差异有统计学意义（P0.01）。3h针刺组、5h和48h药物组IL-1水平与模型对照组比较有降低趋势，差异无统计学意义（均p0.05）；6h、48h针刺组IL-1水平均较模型对照组明显降低，差异有统计学意义（均P0.01）；5h药物组IL-1水平与3h、6h针刺组比较有升高趋势，但无统计学差异（P0.05）；与48h针刺组比较，48h药物组有升高趋势，经统计学处理未见显著差异（p0.05）。各针刺组间比较，48h针刺组的IL-1水平最低，但与3h、6h针刺组比较差异无统计学意义（均P0.05）。见表1.3表1各组大鼠血清IL-18、IL-1水平比较（pg/mL，）与假手术组比较，＊＊P0.01；与模型对照组比较，▲P0.05，▲▲P0.01；与6h针刺组比较，△P0.053讨论IL-18作为多效性的细胞因子，是IL-1细胞因子家族的成员[5][6]。目前认为IL-18作为前炎症细胞因子，促进IL-1β、TNF-α、GM-CSF等炎症因子的产生，是机体外周炎症和自身防御反应的重要调节因子。此外，在特定的局部反应下，应激可促使机体通过诱导IL-1、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α以及CRP产物的生成，进而通过CRH/SP-组织胺系统的激活而启动机体对外界应激的免疫应答反应[7]，从而在神经内分泌免疫网络整体水平上对机体进行调节。本研究探讨“贺氏三通法”对脑缺血再灌注模型大鼠血清IL-18和IL-1含量的影响。结果表明模型组血清IL-18和IL-1含量较假手术组显著增高，提示IL-18和IL-1参与脑缺血再灌注损伤；48h针刺组血清IL-18，6h和48h针刺组血清IL-1含量显著下降，提示“贺氏三通法”可能通过调节IL-1、IL-18的紊乱，参与对脑缺血再灌注脑损伤的保护机制，一方面，IL-18作为炎症凋节因子，调节IL-1等细胞因子的合成，参予脑缺血再灌注损伤引起的炎症级联反应；另一方面，启动机体对外界应激的免疫应答反应，参予机体的神经免疫内分泌网络的调节。前期研究已证实，“贺氏三通法”可调节脑缺血再灌注模型大鼠ACTH的分泌[8]，在ACTH的作用下能刺激IL-18mRNA转录及其蛋白表达[9]进而调节HPA轴的功能状态，达到调节神经-内分泌-免疫网络的失衡。分析不同时间介入治疗对血清IL-18和IL-1含量的影响，结果表明，脑缺血再灌注后48h“贺氏三通法”介入治疗血清IL-18和IL-1含量均最低，提示脑缺血再灌注后48h介入治疗可有效调节血清IL-18和IL-1的紊乱状态，继而抑制脑缺血再灌所引起的级联反应中炎症过程的启动，以启动机体的内源性调节机制。参考文献[1]王麟鹏,刘慧林,刘志顺,赵吉平,赵因,王桂玲,张晓霞,贺普仁.贺氏三通法对缺血性中风患者神经功能缺损的影响:多中心随机对照研究[J].中国针灸,2006;,26(5):309-312.[2]程金莲,刘慧林,刘志顺,赵吉平,赵因,李华岳,张晓霞,王麟鹏,贺普仁.“贺氏三通法”治疗痰瘀阻络型中风临床研究[J].北京中医.2006;25(9):515-517.[3]LongaEZ,WeinsteinPR,CarlsonS,CumminsR.Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats[J].Stroke.1989;20(1):84-91.[4]林文注,王佩.实验针灸学[M].上海:上海科学技术出版社,1994;286-290.[5]DinarelloCA.IL-18:ATh1-inducingproinflammatorycytokineandnewmemberoftheIL-1组别例数IL-18IL-1假手术组822.924±5.4070.209±0.068模型对照组849.300±18.541＊＊0.319±0.028＊＊3h针刺组843.223±14.7940.259±0.0886h针刺组843.977±8.3130.228±0.032▲▲48h针刺组830.853±14.250▲△0.205±0.051▲▲5h药物组848.478±30.5320.283±0.10648h药物组839.412±12.6370.303±0.1364family[J].JAllergClinImmunol,1999;103(1pt1):11-24.[6]NakanishiK,YoshimotoT,TsutsuiH,OkamuraH..Interleukin-18regulatesbothTh1andTh2responses[J].AnnuRevImmunol,2001;19:423-74.[7]CalcagniE,ElenkovI.Stresssystemactivity,innateandThelpercytokines,andsusceptibilitytoimmune-relateddiseases.AnnNYAcadSci.2006;1069:62-76.[8]郭静,张露芬,刘红,孙敬清,马昕宇.“贺氏三通法”对脑缺血再灌注大鼠模型血浆β-EP、ACTH的影响[J].北京中医.2007;26(6):379-81.[9]ParkHJ,KimHJ,LeeJY,ChoBK,GalloRL,ChoDH.Adrenocorticotropinhormonestimulatesinterleukin-18expressioninhumanHaCaTkeratinocytes.JInvestDermatol.2007;127(5):1210-6.作者简介程金莲，女，硕士研究生，副主任医师。研究方向：针灸治疗中风的临床及机理研究。