超声技术在中草药有效成分提取中的应用

1超声技术在中草药有效成分提取中的应用邓明蕊李思茗廖文聪梅南晟周辉深圳职业技术学院生物应用工程系现代制药专业指导教师：崔淑芬摘要超声波提取法在植物成分的提取中已广泛使用。超声波提取法在中国药典一部中的使用率呈逐版上升的趋势。但是，与超声波提取法的逐渐广泛使用成鲜明对比的是，中国药典有关超声的描述很不规范。现行2000版药典只规定“超声处理××时间”。而超声提取与原理有关的因素就有超声功率、频率和时间等；仪器方面的不规范引起的问题则更多，超声波提取仪种类和指标各异（有超声波机、超声波清洗器、超声波发生器）、无固定装置、提取瓶、放置位置等都是随意的。实际工作中，按照药典描述进行操作的结果重现性往往很差。有鉴于此，研制标准的超声波提取仪，使现代技术手段准确用于中药标准中，具有重要的现实意义。本文以中药甘草的有效成分甘草酸提取为例，试验各种实验条件对提取效率的影响，为研制标准超声波提取仪提供基础实验数据。关键词超声提取；甘草；甘草酸概述中草药是祖国医药宝库的一个组成部分,数千年来在我国人民的医疗事业中发挥了重要的作用,同时由于其在治疗方面具有特效、安全等优点,因而受到全球瞩目。但因为中草药中所含的成分相当复杂,不仅含有有效成分,还含有无效成分、组织物等,因此要提高中草药的治疗效果,必须把其有效成分提取出来。提取直接关系到成品中有效成分含量,影响内在质量、临床疗效、经济效益及药品质量生产管理规范(GMP)的实施。目前，无论是国内还是国外，提取中草药化学成分的方法主要采用常规提取法：热提取法(煎煮法、回流提取法)和浸泡提取法(渗漉法、冷浸法)，但是这些常规方法均有许多不足之处，如回流法虽然提取较完全，但是需要加热，耗时较长；煎煮法虽然可以方便地进行工业化生产，但是提取率较低，溶媒用量极大，耗时长；渗漉法虽然不用加热，提取效率也较高，但是耗时很长；冷浸法则是最原始的提取方法、溶媒用量大，耗时太长，提取率也很低。随着新技术、新方法不断出现，使用超声技术提取中草药化学成分是目前中草药研究领域的一大热点。1．超声学超声学是声学的一个重要分支或组成部分。它以研究超声在各种物质中产生、传播、接收及与物质的相互作用、产生的各种效应和应用为主要内容。声波属于机械波，是机械振动在弹性媒质中的传播。它在介质中主要产生两种形式的振荡，即横向振荡(横波)和纵向振荡(纵波)。前者只能在固体中产生，而后者可在固、液、气体中产生。现代声学已涵盖了从10-4—1014Hz的频率范围，相当于从大约3小时振动一次的次声到波长短于固体中原子间距的分子热振动，即跨越了1018量级的宽广频段。这也意味着，现在，人们已经掌握了几乎任意频率声波产生与测量研究的近代技术。2从频率范围而言，超声是指频率高于可听声频率范围的声。根据对人耳的统计规律，在声学中，规定可听声的频率上限为2×104Hz。因而概括地说，超声是频率高于20KHz.的声波。若再具体一点说，超声频段中，频率高于108Hz的超声称为特超声。特别是其中108—1012Hz频段，因与电磁波谱中的微波频段相对应，故又称为微波超声。从功率范围而言，连续波超声一般在毫瓦—几十千瓦范围。脉冲波超声可扩充为几分之一毫瓦—几兆瓦。相应地，从声强角度看，聚焦连续波超声在液体中，因受空化的限制，上限约可达几十千瓦每平方厘米；而聚焦脉冲超声在焦斑中心，甚至可达几十兆瓦每平方厘米。显见，超声学包含了从线性学到非线性声学大跨度动态范围丰富的研究内容。再从传播媒质而言，超声在气体、液体、固体、固熔体等物质中，均能有效地传播。而在这些媒质中，不同频率、功率、强度的超声波，都具有其独特的传播特性的传播性及效应，因而也有其相应的研究内容及广泛的应用。2．超声提取的原理超声波提取中药和天然药物的简易方法和机理说明：在容器中加入提取溶媒（水、乙醇或其他有机溶剂等），将中药材根据需要粉碎或切成颗粒状，放入提取溶媒中；容器的外壁粘接换能器振子或将振子密封于不锈钢盒中投入容器中；开启超声波发生器，振子向提取溶媒中发出超声波，超声波在提取溶媒中产生的空化效应和机械作用一方面可有效地破碎药材的细胞壁，使有效成分呈游离状态并溶入提取溶媒中，另一方面可加速提取溶媒的分子运动，使得提取溶媒和药材中的有效成分快速接触，相互溶合、混合。2．1超声波空化效应空化作用是超声提取的主动力。高频振荡信号，通过超声波换能器转换成高频机械振荡（既超声波）而传播到介质中，由于大能量的超声波作用在液体里，当液体处于稀疏状态下时，液体会被撕裂成很多小的空穴（液体振动而产生数以万计的微小气泡），这些空穴（气泡）在超声波纵向传播形成的负压区产生、生长，而在正压区迅速闭合，这些空穴一瞬间闭合，闭合时产生瞬间高压，即称为空化效应。这种空化效应可细化各种物质以及制造乳浊液，加速待测物中的有效成分进入溶剂，进一步提取可以增加有效成分提取率。2．2超声的机械作用超声波的机械作用主要是辐射压强和超声压强引起的。辐射压强可能引起两种效应：其一是简单的骚动效应；其二是在溶剂和悬浮体之间出现摩擦。这种骚动可使蛋白质变性，细胞组织变形。而辐射压将给予溶剂和悬浮体以不同的加速度，即溶剂分子的速度远大于悬浮体的速度，从而在它们之间产生摩擦，这力量足以断开两碳原子之键，使生物分子解聚。使细胞壁上的有效成分溶解于溶剂之中。32．3超声波热学机理和其他形式的能一样，超声能也会转化为热能。生成热能的多少取决于介质对超声波的吸收。所吸收能量大部分或全部将转化为热能，从而导致组织温度升高。这种吸收声能而引起温度升高是稳定的，所以超声波可以在瞬间使内部温度升高，加速有效成分的溶解。总之，超声波热学机理、超声波机械机制和空化作用是成为超声技术在中药提取应用中的三大理论依据。3．超声提取的特点超声波作用时其效果不仅取决于超声波的强度和频率，而且与被破碎物的结构有一定的关系。计算表明：在水中当超声波辐射面上的强度达3000W／m2时就会产生空化现象，使被破碎的生物体和细胞完全破碎。从理论上讲，确定被破碎物所处介质中气泡的大小后即可选择适宜的超声波频率。但实际上被破碎物所处介质中气泡的大小不是单一的，而是存在着一个分布范围。所以超声波频率应有一定范围的变化，即有一个频率宽带。因此，频率宽带比单一频率的效果又要好一些。有学者把超声提取技术和常规方法提出的有效成分作对照，考察超声提取出的有效成分的结构是否有改变。据文献报道[33-36]，两种方法所得到的有效成分进行薄层层析、红外光谱和核磁共振光谱的对比分析，两者所得到的图谱一致，说明超声提取不会改变有效成分的结构，并且缩短了提取时间，提高了提出率，从而为中草药成分的提取提供了一种快速、高产的新方法。4．超声提取法的利与弊超声波提取法在中草药化学成分提取中的应用已经显示出明显的优势，具有省时、节能、环保、提出率高等优点。在以往的研究中，人们不断地确认超声波提取法的优点和地位，很少论及其不足之处，的确，药典中与之共存的浸渍4小时，时时振摇研磨提取l小时冷浸3小时……等提取方法相比较，超声波提取法确实显示出其独到便利之处。作为国家药品标准的《中华人民共和国药典》对超声波提取法在药品检验中的应用给予了相当的重视，超声波提取法在中国药典一部中的使用率呈逐版上升的趋势。各版药典使用该法制备供试品溶液的药品数量如下：1985年版，1种；1990年版，23种；1995年版，118种；2000年版，267种。但是，与超声波提取法的逐渐广泛使用成鲜明对比的是，中国药典有关超声的描述很不规范。85年版药典注明了超声功率和时间，90、95年版药典在此基础上，有的规定功率、频率不少于××，2000年版全部省略。改为超声处理××时间。这样只规定功率、频率和超声时间或只规定超声时间，虽然这些都是超声提取实验中选择的主要参数，但是任何其它与之相关原理、仪器等因素(如：提取介质、放置位置、提取瓶壁厚薄、被超声物粒度等)未加说明，显然不妥。任何一个因素都可以影响提取效果，单纯强调频率、功率和时间远远不够。仪器方面的不规范引起的问题则更多，超声波提取仪种类和指标各异（有超声波机、超声波清洗器、超声波发生器）、无固定装置、提取瓶、放置位置等都是随意的。实际工作4中，按照药典描述进行操作的结果重现性往往很差。有鉴于此，研制标准的超声波提取仪及其相关配套玻璃仪器，建立一套较为通用标准的超声提取操作方法，使超声波提取法在中国药典中应用真正规范、统一、标准起来，具有重要的现实意义。5．超声提取在甘草有效成分提取中的应用甘草(Licorice)是我国中药中一种重要的药材，系豆科(Leguminosae)甘草属(G1ycyrrhiza)植物（见图1）。素有国老之称，具有止咳化痰、解毒清热、缓急止痛等作用[1-2]。1964年Revgse发现甘草提取物对医治胃馈疡有较好疗效，此后又发现甘草有抗炎、抗变态、抗溃疡[3]、防治病毒性肝炎[4-7]及高脂血症、抗癌[8]、抗利尿[9]、抗干扰素诱生剂及增强细胞免疫调节等功效，特别是近年来发现甘草具有防治艾滋病(AIDS)的效果后[10]，引起了药理学家和化学家的极大重视[11-12]。图1甘草形态图1.植株2.根甘草酸属于三萜化合物类，为甘草的主要有效成分，含量可达3.63%-13.06%[26]。具抗炎、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、增强免疫功能、诱生干扰素等多种生物活性，在食品、化妆品等工业中广泛应用。图2甘草酸结构式图3甘草次酸结构式本文以中药甘草有效成分甘草酸的提取为例，研究影响超声提取的相关参数，为下一步研制标准超声波提取仪提供实验基础。5．1实验部分5．1．1材料和仪器Agilent1100系列高效液相色谱仪，四元梯度泵，在线真空脱气机,7725i手动进样器5(20μL定量环)，二极管阵列检测器；色谱柱：DENALIC18reversed-phasecolumn（VYDAC238DE5415，120A，5μm，4.6mmi.d.×150mm）HP-A.09.01化学工作站；GrantXB14超声波清洗机；滤膜（美国MilliporCorporation，孔径0.45μm）；CAMAGLinomat5半自动点样仪；CAMAGScanner3薄层色谱扫描仪；硅胶GF254预制板10×20cm（Merck，德国）；双槽展开缸；对照品：甘草酸单铵盐（中国亿利资源集团公司李秉经理提供，纯度75%）。有效成分提取所用试剂均为分析纯，HPLC所用试剂规格如下：甲醇，色谱纯，天津；冰醋酸，分析纯，国产试剂；超纯水（电阻率18.2MΩ）。甘草药材采自内蒙亿利集团甘草GAP基地，由中国医学科学院药用植物研究所林寿全教授鉴定为甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根5．1．2基本操作方法5．1．2．1供试液的制备1、回流法：精密称取甘草粉末0.50g，置于圆底烧瓶中，量取30ml甲醇回流1h；取出样品过滤，滤渣用15ml甲醇洗涤，把收集的滤液置于水浴上至溶液蒸干；吸少量分析纯甲醇于蒸发皿中，使成份溶解，用滴管从棉花中吸取溶液，用甲醇定容5ml，过0.45u滤膜。2、超声法：精密称取甘草粉末0.50g，置于100ml容量瓶中，量取30ml甲醇；超声提取一定时间，取出样品过滤，滤渣用15ml甲醇洗涤，把收集的滤液置于水浴上至溶液蒸干；吸少量分析纯甲醇于蒸发皿中，使成份溶解，用滴管从棉花中吸取溶液，移入5ml容量瓶中，用甲醇定容到5ml；过0.45u滤膜。3、冷浸法：精密称取甘草粉末0.50g，置于容器中，用30ml甲醇室温浸渍24h，取出样品过滤，滤渣用15ml甲醇洗涤，把收集的滤液置于水浴上至溶液蒸干；吸少量分析纯甲醇于蒸发皿中，使成份溶解，用滴管从棉花中吸取溶液，移入5ml容量瓶中，用甲醇定容到5ml；过0.45u滤膜。5．1．2．2检测方法1、HPLC分析：流动相A：3%醋酸/水，流动相B：乙腈；梯度洗脱。DAD检测器，检测波长为252nm。进样20μL2、TLCS分析：展开剂组成：醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15：1：1：2）。扫描条件D2&W灯，254nm单波长吸收扫描，Win