遗传信息传递

第五章遗传信息的传递第四节转录RNA的生物合成DNA指导下的RNA的合成：转录转录后RNA的加工RNA指导下的RNA的合成：病毒RNA的复制转录、有义链和反义链E.coliRNA聚合酶α-鹅膏蕈碱二、启动子与转录因子大肠杆菌RNA聚合酶的启动子大肠杆菌不同的σ因子识别不同序列的启子:（二）真核生物的启动子和转录因子1.类别I启动子启动子包括：核心启动子：-5～+20，足以启动转录，效率很低上游调控元件（UCE）：-180～-107，增强转录的起始二者各有一个富含GC的特异序列，约85％相同。RNA聚合酶Ⅰ的转录因子有：上游结合因子（upstreambindingfactor,UBF1）：单链多肽，它特异地结合在核心启动子和UCE的富含GC的元件上选择因子1（selectivityfactor1,SL1）：四聚体蛋白质，含有1个TBP（TATA-结合蛋白）和3个TAFI2.类别II启动子顺式作用元件（cis-actingelement）DNA序列反式作用因子（trans-actingfactor）蛋白因子（多）类别II启动子包括四类调控元件基本启动子起始子上游元件应答元件协助RNA聚合酶Ⅱ起作用的转录因子分为：(1)通用因子（基本因子）：作用于基本启动子和起始子，决定转录的起始位点。(2)上游因子：作用于上游元件，其活性不受调控。提高启动的效率，是那些功能相当高的启动子所必需的。(3)诱导型因子：作用与上游因子相同，但是受到调控。它们结合的元件叫做应答元件。一个仅含有被基础因子和上游因子所识别的元件的启动子能在任何种类的细胞中进行转录。可见这种启动子担负着细胞中那些组成型基因，有时也叫做持家基因(housekeepinggene)的表达。起始子（initiator,Inr）:转录起点位置处有一保守序列真核RNA聚合酶Ⅱ需要许多其它蛋白因子真核RNA聚合酶Ⅱ和转录因子在启动子上的装配应答元件热休克元件HSE共有序列CNNGAANNTCCNNG可被热休克因子HSF识别血清效应元件SRE共有序列CCATATTAGG可被血清效应因子SRF识别和作用干扰素－γ的效应元件IGRE的共有序列TTNCNNNAA可被信号转导及转录活化蛋白STAT识别和作用。3.类型III启动子RNA聚合酶Ⅲ的启动子有两种：5SrRNA、tRNA和scRNA基因的启动子在起始位点的下游，即在基因的内部，称为内部启动子两种内部启动子都是由两个短序列元件构成的，两个元件用可变的序列分隔开。snRNA(核内小RNA)基因的启动子为上游启动子。三、终止子(terminator)和终止因子大肠杆菌两类终止子的回文结构不依赖Rho-因子的终止子：含富GC的回文序列和寡聚U序列。（二）真核细胞的转录终止RNA聚合酶II的转录产物在3’末端切断，然后腺苷酸化，而无终止作用。在结构基因最后一个外显示子的3＇端，常有一组共同序列AATAAA，其下游还有相当多的GT序列。这些序列称为转录修饰点。当RNA聚合酶Ⅱ转录出AAUAAA后，聚腺苷酸特异因子（CPSF）能识别它并与它结合。在CPSF以及切割活化因子（CstF）等因子的指导下，特异的核酸内切酶在AAUAAA下游11-30核苷酸处切断RNA链，mRNA前体（hnRNA）的转录即告终止。四、真核生物转录（与原核生物转录比较）4.6.7.8.StandardssamecopynumberinallcellsexpressedinallcellsmediumcopynumberadvantageouscorrectionmoreaccurateStandardsCommonlyusedstandardsGlyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenasemRNABeta-actinmRNAMHCI(majorhistocompatabilitycomplexI)mRNACyclophilinmRNAmRNAsforcertainribosomalproteinsE.g.RPLP0(ribosomalprotein,large,P0;alsoknownas36B4,P0,L10E,RPPO,PRLP0,60SacidicribosomalproteinP0,ribosomalproteinL10,ArbporacidicribosomalphosphoproteinP0)28Sor18SrRNAUsesofRNaseProtectionAssays(RPAs)1.DeterminerelativeabundanceofanRNA2.Map5’and/or3’endsofanRNA3.Determinepresenceorabsenceofintron/exons(codingsequence,alternativesplicing,etc…)六、启动子的研究转录起点的确定：5’-RACERNaseProtectionandPrimerExntensionAssaysCanBothMapEndsofRNAsRNaseProtectionAssay-5’and3’mappingaswellasdeterminingintrons&exonsPrimerExtension-5’endmapping(butiseasier/faster)UsesofRNaseProtectionAssays(RPAs)1.DeterminerelativeabundanceofanRNA2.Map5’and/or3’endsofanRNA3.Determinepresenceorabsenceofintron/exons(codingsequence,alternativesplicing,etc…)PrimerExtensionMethodtoMap5’endofRNAMostcommonmethodusedtomap5’endAlsousedtodeterminerelativeabundanceKnowing5’endofRNAhelpsdeterminetranscriptionstartsitesandsiteofpromoterinDNASimilartoreversetranscriptasestepofRT-PCR,butthePCRstepisnotperformedPrimerExtensionMethod:Step-by-Step1.ExtracttotalRNA(Tri-Reagentmethod)2.“End-label”primerat5’endwith32P-phosphate:-32P-γATP+T4PolynucleotideKinase3.SynthesizecDNAusingReverseTranscripase-denatureRNAsample(75oC-5min)-Anneal“end-labeled”primer(50oC-5min)-synthesizecDNAbyaddingRTenzymefor15minat42-50oC(dependingonRT)4.ElectrophoreslabeledcDNAin“denaturing”polyacrylamidegelwithsequencing/sizeladder5.ExposetophosophimagerorX-rayfilmpetDmRNAPrimerExtensionDataWS5=ReversePrimerUsed5’-GCCAAAACGCCATAAACTTTTC-3’UsepetDsequenceinAppendixtoMap5’endNote,muchofthesequencebetweenprimerandsequenceshown“ranoff”ofgelduringelectrophoresis,whichisok.