遗传学DNA甲基化综述

分子生物学综述题目：DNA甲基化的研究方法与技术姓名：常一鸣班级：15级检验一班学号：2015222672摘要：DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。关键字：表观遗传学；DNA甲基化；甲基化研究方法1导言早在1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R.Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断，也就是人们现在比较统一的认识[1]，即在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA甲基化最为常见。其主要任务是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱，即不同组织与疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及其分布频率的图谱，以指导和系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生中的重要作用[2]。DNA甲基化的研究，逐渐成为新的研究热点。随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。让我一一介绍现有的大部分DNA甲基化研究方法，并对其相关特性进行简要分析与总结。1.1DNA甲基化及CpG岛DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达[3]。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体[4]。1.2DNA甲基化的生物学作用1.2.1DNA甲基化与遗传印记、胚胎发育DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的（Li等1992年和Okano等1999年）[3]。此外，等位基因的抑制(allelicrepression)被印记控制区(imprintingcontrolregions,ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的[4]。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-WiedemannSyndrome,BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等[5]。1.2.2DNA甲基化与肿瘤甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)[4]和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高,例如：胰岛素样生长因子-2（IGF-2）基因印记丢失导致多种肿瘤,如Wilm’s瘤[6]。1．3DNA甲基化的研究方法近15年来，人们越来越认识到DNA甲基化研究的重要性，开发出一列检测DNA的方法。根据研究目的这些方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同可以分为：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法等。2甲基化研究方法学回顾2.1基因组整体水平甲基化分析2.1.1高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法HPLC是一种比较传统的方法，能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。它由Kuo等1980年[7]首次报道。过程是将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5mC/(5mC+5C)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA甲基化的标准方法。但它需要较精密的仪器。Fraga等2002年[8]运用高效毛细管电泳法(HPCE)处理DNA水解产物，以确定5mC的水平。与HPLC相比，HPCE更加简便、快速、经济。HPLC及HPCE测定基因组整体DNA甲基化水平的敏感性均较高。Oefner等1992年[9]提出变性高效液相色谱法（DHPLC）用于分析单核苷酸和DNA分子。邓大君等2001[10]将其改进与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增，由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞嘧啶，因此原甲基化的在PCR扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长，这样就可以测定出PCR产物中甲基化的情况。这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的片段中所有CpG位点甲基化的情况，但不能对甲基化的CpG位点进行定位。2.1.2SssI甲基转移酶法[11]SssI甲基转移酶能够催化DNA的CpG位点发生甲基化。3H-S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)在SssI甲基转移酶催化作用使基因组DNA的CpG位点发生甲基化。通过测定剩余的放射性标记的SAM即可得到原基因组整体甲基化水平，即测到的放射性强度与所测DNA甲基化水平成反比。这种方法的缺点是所使用的SssI甲基转移酶不稳定，致结果不够精确。2.1.3免疫化学法[12]这种方法是基于单克隆抗体能够与5mC发生特异性反应。应用荧光素标记抗体使之与预先已固定在DEAE膜上的样品DNA特异性结合，对DEAE膜上的荧光素进行扫描得到5mC的水平，其荧光素强度与5mC水平成正比。Oakeley等1997年[23]报道了这种方法。这种方法需要精密的仪器。2.1.4氯乙醛法Oakeley等1999年[13]首先描述了这种使用氯乙醛和荧光标记的方法。首先，将DNA经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变（Frommer等1992年）[14]，然后经过银或色谱柱去除DNA链上的嘌呤，再将样品与氯乙醛共同孵育，这样5mC就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶，荧光的强度与原5mC的水平成正比。这种方法可以直接测定基因组整体5mC水平。其优点是所用试剂价格低廉且稳定性好，避免了放射性污染，但缺点是费时费力，而且氯乙醛是一种有毒的物质。随着甲基化研究的不断深入，甲基化分析技术将逐步完善。完善的研究技术将提供强有力的技术支持，从而为表观遗传、胚胎发育、基因印记及肿瘤研究提供一些新的思路。参考文献：[1]WuCT,MorrisJR.Genes,geneticsandepigenetics:acorrespondence[J].Science,2001,293:1103-1105.[2]黄庆,郭颖,府伟灵.人类表观基因组计划[J].生命的化学,2004,24(2):101-102.[3]DahlC,GuldbergP.DNAmethylationanalysistechniques[J].Biogerontology,2003,4(4):233-250.[4]董玉玮,侯进慧,朱必才等.表观遗传学的相关概念和研究进展[J].生命的化学,2005,22(1):1-3.[5]张永彪,褚嘉祐.表观遗传学与人类疾病的研究进展[J].遗传,2005,27(3):466-472.[6]FeinbergAP,TyckoB.Thehistoryofcancerepigenetic[J].NatRevCancer,2004,4(2):143-153.[7]KuoKC,McCuneRA,GehrkeCW,etal.Quantitativereversed-phasehighperformanceliquidchromatographicdeterminationofmajorandmodifieddeoxyribonucleosidesinDNA[J].NucleicAcidsRes,1980,8:4763-4776.[8]FragaMF,UriolE,BorjaDL,etal.High-performancecapillaryelectrophoreticmethodforthequantificationof5-methyl2-deoxycytidineingenomicDNA:applicationtoplant,animalandhumancancertissues[J].Electrophoresis,2002,23:1677-1681.[9]Oefner,PJ,BonnGK,HuberCG,etal.Comparativestudyofcapillaryzoneelectrophoresisandhigh-performanceliquidchromatographyintheanalysisofoligonucleotidesandDNA.[J].Chromatogr,1992,625(2):331-3401.[10]邓大君,邓国仁,吕有勇等.变性高效液相色谱法检测CpG岛胞嘧啶甲基化[J].中华医学杂志,2001,80(2),158–1611.[11]WuJ,IssaJ,HermenJ,etal.ExpressionofanexogenouseukaryoticDNAmethyltransferasegeneinducestransformationofNIN3T3ceils[J].ProcNatlAcadSciUSA,1993,90(19):8891–8895.[12]OakeleyEJ,PodestaA,JostJP.DevelopmentalchangesinDNAmethylationofthetwotobaccopollennucleiduringmaturation[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,94:11721–11725.[13]OakeleyEJ,SchmittF,JostJP.Quantificationof5-methylcytosineinDNAbythechloroacetaldehydereaction[J].Biotechniques,1999,27:744-6,748-50,752.[14]FrommerM,McDonaldLE,MillarDS,etal.Agenomicsequencingprotocolthatyieldsapositivedisplayof5-methylcytosineresiduesinindividualDNAstrands[J].ProcNatlAcadSciUSA,1992,89:1827–1831.